使用鈣指示劑AM酯類

1.使用鈣指示劑AM Esters加載細胞：

AM酯是非極性酯，其易于穿過活細胞膜，并且通過活細胞內的細胞酯酶快速水解。AM酯廣泛用于非侵入性地將各種極性熒光探針裝載到活細胞中。但是，使用AM酯時必須小心，因為它們易于水解，特別是在溶液中。它們應該用高質量的無水二甲基亞砜（DMSO）重新配制。DMSO儲備溶液應在-20°C下干燥儲存并避光。在這些條件下，AM酯應穩定數月。

以下是我們推薦的將AM酯加載到活細胞中的方案。該協議僅提供指南，應根據您的具體需求進行修改。

a）在高質量無水DMSO中制備2至5 mM AM酯原液。

b）在實驗當天，將鈣指示劑溶解在DMSO中或將等份的指示劑儲備溶液解凍至室溫。使用0.04％Pluronic®F-127在您選擇的緩沖液（如Hanks和Hepes緩沖液）中制備2至20μM的工作溶液。對于大多數細胞系，我們建議鈣指示劑的終濃度為4-5 uM。細胞加載所需指標的確切濃度必須根據經驗確定。為避免因過載和潛在染料毒性引起的任何偽影，建議使用可產生足夠信號強度的小探針濃度。

注意：非離子洗滌劑Pluronic®F-127有時用于增加鈣指示劑AM 酯的水溶性。

c）如果您的細胞（如CHO細胞）含有有機陰離子轉運蛋白，可以將丙*舒（2-5 mM）或磺吡酮（0.2-0.5 mM）添加到染料工作溶液中（終濃度為1）對于丙*舒而言為-2.5mM，對于磺胺吡喃酮為0.1-0.25mM，以減少脫酯化指示劑的泄漏。

d）將等體積的染料工作溶液（來自步驟b或c）加入細胞板中。

e）將染料加載板室在溫度或37℃下孵育20分鐘（特別是Fluo-8AM）至2小時，然后將板在室溫下再孵育30分鐘。

f） 用HHBS或您選擇的緩沖液（含有陰離子轉運蛋白抑制劑，如1mM丙*舒，如果適用）替換染料工作溶液，以去除多余的探針。

g）在所需的Ex / Em波長下進行實驗。

2.測量細胞內鈣響應：

圖1. 沒有丙*舒的CHO-M1細胞中內源性P2Y受體對ATP的反應。在96孔黑壁/透明底板中，將CHO-M1細胞以每100μL/孔40,000個細胞接種過夜。將100μl的4μMFluo -3AM，Fluo- 4AM 或Cal202®AM在HHBS中加入孔中，并將細胞在37℃下孵育2小時。用100μlHHBS替換染料加載培養基，加入50μl300μMATP，然后使用FITC通道用熒光顯微鏡（Olympus IX71）成像。

圖2. 用Cal-520 或Fluo-4 AM 測量的CHO-K1細胞中ATP刺激的內源性P2Y受體的鈣響應。在96孔黑壁/透明底板中，將CHO-K1細胞以每100μL /孔50,000個細胞接種過夜。100μL的5 μ 中號的Fluo-4 AM或校準- 520® AM與（A）或不具有（B）2.5mM丙*舒加入到細胞中，并將細胞在37下溫育?下進行2小時。 通過FlexStation（Molecular Devices）添加ATP（50μL/孔）以達到終指示的濃度。

使用鈣指示劑鹽

為了確定溶液的游離鈣濃度或 單波長鈣指示劑的K d，使用以下等式：

[Ca] = K d [F - F min ] / F max - F]

       其中F是實驗鈣水平下指示劑的熒光，F min 是不存在鈣時的熒光，F max是鈣飽和探針的熒光。解離常數（K d）是探針對鈣的親和力的量度。與校準溶液相比，熒光指示劑的Ca 2+結合和光譜性質在細胞環境中變化非常顯著。 細胞內指標的原位校準通常產生顯著高于體外測定的K d值。 通過將加載的細胞暴露于受控的Ca來進行原位校準 在離子載體存在下的2+緩沖液，例如A-23187,4-溴A-23187和離子霉素。或者，細胞透化劑如洋地黃皂苷或X-100可用于將指示劑暴露 于細胞外培養基的受控Ca 2+水平。表1列出了一些鈣試劑的K d值供您參考。

使用鈣指示劑結合物

       與游離離子指示劑相比，這些相同指示劑的葡聚糖綴合物表現出減少的區室化和低得多的染料滲漏率。由于葡聚糖的分子量，凈電荷，標記程度和染料的性質可能影響實驗，因此建議研究人員查閱主要文獻以獲得特定應用的信息。