使用鈣指示劑AM酯類

1.使用鈣指示劑AM Esters加載細胞：

AM酯是非極性酯，其易于穿過活細胞膜，并且通過活細胞內的細胞酯酶快速水解。 AM酯廣泛用于非侵入性地將各種極性熒光探針裝載到活細胞中。 但是，使用AM酯時必須小心，因為它們易于水解，特別是在溶液中。 它們應該用高質量的無水二甲基亞砜（DMSO）重新配制。 DMSO儲備溶液應在-20°C下干燥儲存并避光。 在這些條件下，AM酯應穩定數月。

以下是我們推薦的將AM酯加載到活細胞中的方案。 該方案僅提供指南，實際應根據您的具體需求進行修改。

a）在高質量無水DMSO中制備2至5 mM AM酯原液。

b）在實驗當天，將鈣指示劑溶解在DMSO中或將等份的指示劑儲備溶液解凍至室溫。使用0.04％Pluronic®F-127在您選擇的緩沖液（如Hanks和Hepes緩沖液）中制備2至20μM的工作溶液。 對于大多數細胞系，我們建議鈣指示劑的終濃度為4-5 uM。細胞加載所需指標的確切濃度必須根據經驗確定。為避免因過載和潛在染料毒性引起的任何偽影，建議使用可產生足夠信號強度的小探針濃度。

注意：非離子洗滌劑Pluronic®F-127有時用于增加鈣指示劑AM酯的水溶性。

c）如果您的細胞（如CHO細胞）含有有機陰離子轉運蛋白，可以將丙*舒（2-5 mM）或磺吡酮（0.2-0.5 mM）添加到染料工作溶液中（濃度為1） 丙*舒為-2.5 mM，對于磺吡酮為0.1-0.25 mM，以減少去酯化指標的泄漏。

d）將等體積的染料工作溶液（來自步驟b或c）加入細胞板中。

e）將染料加載板室在溫度或37℃下孵育20分鐘（特別是Fluo-8AM）至2小時，然后將板在室溫下再孵育30分鐘。

注意1：降低加載溫度可能會減少指示符的劃分。

注意2：孵育Cal-520 AM超過2小時可以為某些細胞系提供更好的信號強度

f）用HHBS或您選擇的緩沖液（含有陰離子轉運蛋白抑制劑，如1mM丙*舒，如果適用）替換染料工作溶液，以去除多余的探針。

g）在所需的Ex / Em波長下進行實驗。