操作步驟

1.準備HHBS緩沖液，10％Pluronic®F-127溶液和25 mM Probenecid溶液。

2.在高質量無水DMSO中制備2 mM至5 mM Calcein UltraGreen AM原液。
2.1使用Calcein UltraGreen AM的量：1毫克
2.2所需濃度：2 mM
2.3在合適的容器中，將1mg鈣黃綠素UltraGreen TM AM與823.09μL無水DMSO混合。

3.使用10μMCalceinUltraGreen AM 4在HHBS中制備2X工作溶液，0.08％Pluronic®F-127和2 mM丙*舒。
3.1終孔內濃度的Calcein UltraGreen AM：5μM
3.2Pluronic®F-127的終孔內濃度：0.04％
3.3終孔內濃度的丙*舒：1mM
3.4在合適的容器中混合16μL的Calcein UltraGreen AM，25.6μL的10％Pluronic®F-127和256μL的25 mM丙*舒。然后，添加HHBS或您選擇的緩沖液，直到體積為3.2 mL。
注意：對于大多數細胞系，我們建議Calcein UltraGreen AM的終濃度為4至5μM。
注意：推薦的Pluronic F-127井濃度終為0.02％至0.04％。
注意：推薦的終濃度為1至2.5 mM的Probenecid。

4.將100μL染料工作溶液加入已經含有100μL培養基的所需孔中。
4.1該步驟將染料工作溶液從2X稀釋至1X，并將每種組分的終濃度調節至以下：5μM鈣黃綠素UltraGreen AM，0.04％Pluronic®F-127,1mM丙*舒。

5.孵育染料
5.1將染料加載板在細胞培養箱中孵育20-60分鐘。
5.2將染料加載板在室溫下孵育30分鐘。

6.用1.0 mM Probenecid準備HHBS緩沖液（或您選擇的緩沖液）。
6.1在合適的容器中加入160μL的25mM丙*舒。 接下來，添加HHBS或您選擇的緩沖液，直到體積為4 mL。

7.用HHBS緩沖液或您選擇的緩沖液替換染料工作溶液，使用1.0 mM Probenecid。
7.1首先，從所需孔中除去200μL染料工作溶液和培養基。
7.2在相同的孔中加入200μL含有1.0mM丙*舒的HHBS（或您選擇的緩沖液）。

8.運行實驗
8.1為您的樣品添加所需的處理。
8.2以Ex / Em = 496/524 nm運行實驗。