Amplite NADH檢測(cè)試劑盒（熒光法）是美國(guó)AAT Bioquest 研發(fā)的檢測(cè)NADH的試劑盒，煙*胺腺嘌呤二核苷酸（NAD +）和煙*胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP +）是細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的兩種重要的輔因子。 NADH是NAD +的還原形式，NAD +是NADH的氧化形式。 NAD形成NADP，通過(guò)酯鍵將磷酸基團(tuán)添加到腺苷核苷酸的2'位置。

傳統(tǒng)的NAD / NADH和NADP / NADPH測(cè)定通過(guò)監(jiān)測(cè)340nm處NADH或NADPH吸收的變化來(lái)完成。 傳統(tǒng)NAD / NADH和NADP / NADPH測(cè)定的短UV波長(zhǎng)使得這些方法具有低靈敏度和高干擾。 由于NAD和NADH的吸收較弱，紫外吸收方法需要較大的樣品量，如果樣品的可用性有限，則使相同的NAD和NADH測(cè)量不實(shí)用。

這種Amplite 熒光NADH檢測(cè)試劑盒為檢測(cè)NADH提供了一種便捷的方法。 系統(tǒng)中的酶在酶循環(huán)反應(yīng)中特異性識(shí)別NADH。 此外，該測(cè)定具有非常低的背景，因?yàn)槠湓诩t色可見范圍內(nèi)運(yùn)行，這顯著降低了生物樣品的干擾。 Amplite 熒光NADH分析試劑盒提供靈敏的一步法分析，可在100μL分析體積（1μM）內(nèi)檢測(cè)少至100皮摩爾的NADH。 可以以方便的96孔或384孔微量滴定板形式進(jìn)行測(cè)定。 其信號(hào)可通過(guò)Ex / Em = 540/590 nm的熒光酶標(biāo)儀或~576 nm的吸光度酶標(biāo)儀輕松讀取。百螢生物是AAT Bioquest的中國(guó)代理商，為您提供優(yōu)質(zhì)的Amplite NADH檢測(cè)試劑盒（熒光法）。

實(shí)驗(yàn)方案

96孔板測(cè)定示例

概述

準(zhǔn)備NADH反應(yīng)混合物（50μL）

加入NADH標(biāo)準(zhǔn)品或測(cè)試樣品（50μL）

在室溫下孵育15分鐘 -  2小時(shí)

監(jiān)測(cè)Ex / Em = 540/590 nm處的熒光強(qiáng)度

1.準(zhǔn)備NADH儲(chǔ)備溶液：
將200μLPBS緩沖液加入到NADH標(biāo)準(zhǔn)品（組分C）的小瓶中以制備1mM（1nmol / L）NADH儲(chǔ)備溶液。
注意：未使用的NADH儲(chǔ)備溶液應(yīng)分成單次使用的等分試樣并儲(chǔ)存在-20℃。

2.準(zhǔn)備NADH反應(yīng)混合物：
將10mL Amplite NADH測(cè)定緩沖液（組分B）加入NADH再循環(huán)酶混合物（組分A）的瓶中，并充分混合。
注意：這種NADH反應(yīng)混合物足以用于兩個(gè)96孔或四個(gè)384孔板。未使用的NADH反應(yīng)混合物應(yīng)分成單次使用的等分試樣并儲(chǔ)存在-20℃。

3.準(zhǔn)備NADH標(biāo)準(zhǔn)品的系列稀釋液（0至100μM）：
3.1將50μL的NADH儲(chǔ)備溶液（來(lái)自步驟1）加入到450μLPBS緩沖液（pH 7.4）中以產(chǎn)生100μM（100pmol / L）NADH標(biāo)準(zhǔn)溶液。
注意：稀釋的NADH標(biāo)準(zhǔn)溶液不穩(wěn)定，應(yīng)在4小時(shí)內(nèi)使用。

3.2取200μL的100μMNADH標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行1：3連續(xù)稀釋，得到30,1,10,3,1,0.3,0.1和0μM的NADH標(biāo)準(zhǔn)品系列稀釋液。

3.3如表1和表2所述，將NADH標(biāo)準(zhǔn)品和含有NADH的測(cè)試樣品的系列稀釋液加入到固體黑色96孔微量培養(yǎng)板中
注意：根據(jù)需要準(zhǔn)備細(xì)胞或組織樣本。

表1實(shí)心黑色96孔微孔板中NADH標(biāo)準(zhǔn)品和測(cè)試樣品的布局

注意：NS = NADH標(biāo)準(zhǔn)，BL =空白對(duì)照，TS =測(cè)試樣品

表2每個(gè)孔的試劑組成

*注意：將連續(xù)稀釋的NADH標(biāo)準(zhǔn)品（0.1μM至100μM）加入NS1至NS7的孔中，一式兩份

4.在上清液反應(yīng)中運(yùn)行NADH測(cè)定：
4.1將50μL的NADH反應(yīng)混合物（來(lái)自步驟2）加入NADH標(biāo)準(zhǔn)品，空白對(duì)照和測(cè)試樣品的每個(gè)孔中（參見步驟3.3），使總NADH測(cè)定體積為100μL/孔
注意：對(duì)于384孔板，每孔加入25μL樣品和25μLNADH反應(yīng)混合物。

4.2在室溫下孵育反應(yīng)15分鐘至2小時(shí)，避光。
4.3用Ex / Em = 530-570 / 590-600nm的熒光板讀數(shù)器監(jiān)測(cè)熒光增加（在Ex / Em = 540 / 590nm處佳）。
注1：也可將板的內(nèi)容物轉(zhuǎn)移到白色透明底板上，用吸光度酶標(biāo)儀在576±5nm波長(zhǎng)下讀數(shù)。 與熒光讀數(shù)相比，吸收檢測(cè)具有較低的靈敏度。
注2：對(duì)于基于細(xì)胞的NADH測(cè)量，建議使用ReadiUse 哺乳動(dòng)物細(xì)胞裂解緩沖液* 5X *（cat＃20012）裂解細(xì)胞。