Amplite NADP+/NADPH檢測試劑盒(比色法)是AAT Bioquest研發(fā)的檢測NADP+/NADPH的試劑盒，煙*胺腺嘌呤二核苷酸（NAD +）和煙*胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP +）是細胞中發(fā)現(xiàn)的兩種重要的輔因子。NADH是NAD +的還原形式，NAD +是NADH的氧化形式。 NAD形成NADP，通過酯鍵將磷酸基團添加到腺苷核苷酸的2'位置。NADP用于合成代謝生物反應(yīng)，例如脂肪酸和核酸合成，其需要NADPH作為還原劑。在葉綠體中，NADP是在光合作用的初步反應(yīng)中重要的氧化劑。通過光合作用產(chǎn)生的NADPH用作卡爾文光合作用循環(huán)中生物合成反應(yīng)的還原能力。傳統(tǒng)的NAD / NADH和NADP / NADPH測定通過監(jiān)測340nm處NADH或NADPH吸收的變化來完成。該方法具有低靈敏度和高干擾，因為該測定在需要昂貴的石英微孔板的UV范圍內(nèi)進行。

Amplite™比色總NADP和NADPH檢測試劑盒為敏感檢測NADP和NADPH提供了一種便捷的方法。 系統(tǒng)中的酶特異性識別酶循環(huán)反應(yīng)中的NADP / NADPH，其顯著提高了檢測靈敏度。 此外，該測定具有非常低的背景，因為其在較長波長范圍內(nèi)運行，這顯著降低了來自生物樣品的干擾。 該實驗證明了高靈敏度和低干擾。百螢生物是AAT Bioquest的中國代理商，為您提供優(yōu)質(zhì)的Amplite NADP+/NADPH檢測試劑盒(比色法)。

Amplite™比色總NADP和NADPH分析試劑盒提供靈敏的一步法分析，可在100μL分析體積（100 nM）內(nèi)檢測少至10皮摩爾的NADP（H）。 該測定可以以方便的96孔或384孔微量滴定板形式進行，并且容易適應(yīng)自動化而無需分離步驟。 其信號可通過吸光度酶標儀在~575nm或~570nm至~605nm的吸光度比下輕松讀取，以提高測定靈敏度。 如果需要更高的靈敏度，建議使用Cat#15259或15264。

96孔板測定示例

概述

準備NADP / NADPH反應(yīng)混合物（50μL）

加入NADPH標準品或測試樣品（50μL）

在室溫下孵育15分鐘--2小時

監(jiān)測575±5nm處的吸光度強度

注意：在開始實驗之前，在室溫下解凍每個試劑盒組分中的一個。

操作方法

1.準備NADPH原液：

將200μLPBS緩沖液加入到NADPH標準品（組分C）的小瓶中，得到1mM（1nmol / L）NADPH儲備溶液。

注意：未使用的NADPH原液應(yīng)分成單次使用的等分試樣并儲存在-20℃。

2.制備NADP / NADPH反應(yīng)混合物：

將10mL NADP / NADPH傳感器緩沖液（組分B）加入NADP / NADPH再循環(huán)酶混合物（組分A）的瓶中，并充分混合。

注意：這種NADP / NADPH反應(yīng)混合物足以用于兩個96孔板。 未使用的NADP / NADPH混合物應(yīng)分成單次使用的等分試樣并儲存在-20℃。

3.準備NADPH標準品的連續(xù)稀釋液（0至10μM）：

3.1將10μLNADPH儲備溶液（來自步驟1）加入990L PBS緩沖液中以產(chǎn)生10M（10pmol / L）NADPH標準溶液。

注意：稀釋的NADPH標準溶液不穩(wěn)定，應(yīng)在4小時內(nèi)使用。

3.2取200μL10μMNADPH標準溶液進行1：3連續(xù)稀釋，得到NADPH標準品的3,1,0.3,0.1,0.03,0.01,0.003和0μM連續(xù)稀釋液。

3.3如表1和表2所述，將NADPH標準品和含有NADP / NADPH的測試樣品的系列稀釋液加入白色/透明底96孔微孔板中

注意：根據(jù)需要準備細胞或組織樣本。

表1在白色/透明底96孔微孔板中的NADPH標準品和測試樣品的布局

注意：NS = NADPH標準，BL =空白對照，TS =測試樣品。

表2.每個孔的試劑組成

注意：將連續(xù)稀釋的NADPH標準品從0.003μM至3μM加入NS1至NS7的孔中，一式兩份。 高濃度的NADPH（例如，>100μM，終濃度）可能由于NADPH傳感器的過度氧化而導(dǎo)致信號降低。

4.在上清液中運行NADP / NADPH測定：

4.1將50μLNADPH反應(yīng)混合物（來自步驟2）加入NADPH標準品，空白對照和測試樣品的每個孔中（參見步驟3.3），使總NADPH測定體積為100μL/孔。

注意：對于384孔板，每孔加入25μL樣品和25μLNADPH反應(yīng)混合物。

4.2在室溫下孵育反應(yīng)15分鐘至2小時，避光。

4.3用吸光度讀數(shù)儀在575±5 nm或~570 nm至~605 nm的吸光度比下觀察吸光度的增加，以提高檢測靈敏度。

注意1：對于NADP / NADPH比率測量，建議使用試劑盒15263。

注意2：對于基于細胞的NADP / NADPH測量，建議使用ReadiUse™哺乳動物細胞裂解緩沖液* 5X *（Cat#20012）裂解細胞。