熒光標記

　　熒光修飾可以通過共價鍵的形式連接在多肽序列的N端或C端，但是更推薦在N端進行修飾。以下為合生生物常用熒光修飾以及發光顏色。

    

　　多肽熒光標記結合成像技術后可用于識別特定靶點。共聚焦或熒光顯微鏡的體外成像仍然是研究細胞內各種生物過程和相互作用十分有效的方法之一。與蛋白質不同，這些肽定位于肌動蛋白上的特定靶點，不易聚集蛋白質，因此非常適合于體外跟蹤。同樣，FITC標記的CPP也可被用于細胞內組分的成像，且其細胞毒性低。

　　其中，FITC是一種胺活性的熒光染料，可廣泛的用于標記多肽和蛋白質。合生生物在N端標記Fitc，都會建議在后面一個氨基和由異硫氰酸酯與氨基反應產生的硫脲鍵之間引入烷基間隔器（alkyl spacer）如AJYS（Ahx）。鏈接切割需要酸性環境，在N端標記FITC的多肽需經歷環化作用來形成熒光素，通常會伴有后面一個氨基酸的去除，但當有一個間隔器如AJYS，或者是通過非酸性環境將目的肽從樹脂上切下來時，這種情況可避免。空間位阻被認為是在熒光染料前使用Ahx的主要原因，而不是為什么FITC不能直接偶聯在多肽上的原因。

　　下圖是合生生物多肽熒光標記經典案例之一：

　　合成FITC-Ahx-RAKWNNTLKQIASK的MS&HPLC圖譜

　　對于較長的序列，建議使用FRET pairs(fluorescence resonance energy transfer pairs)進行修飾。

　　熒光共振能量轉移（FRET）是描述兩個熒光團之間的能量轉移的機制。由于FRET效率部分基于供體和受體分子之間的距離，因此該技術通常用于研究酶效率，蛋白質-蛋白質相互作用或其他分子動力學。

　　圖1.蛋白酶研究的FRET機制。

　　(當肽保持完整時，受體分子將淬滅供體分子，并且不會檢測到熒光。如果序列被蛋白酶活性切割，則受體將不再淬滅供體，并且將檢測到熒光信號)

　　FRET肽是研究肽酶特異性的便利工具，由于其反應過程可被連續監測，為酶活性的檢測提供了一個便捷的方法。

　　供體/受體對的肽鍵水解后產生的熒光可衡量納摩爾級濃度的酶活性。當FRET肽是完整的，表現出的是內部的熒光猝滅，但當供體/受體對的任何肽鍵斷裂就會釋放出熒光，此熒光可被連續檢測，從而可對酶的活性進行定量分析。

　　FRET肽可作為各類酶研究的合適底物，比如：

　　1.肽酶、蛋白酶、激酶、磷酸酶的動力特征和功能特征。

　　2.對新的蛋白水解酶的篩選和檢測。

　　3.對多肽折疊的構象研究。