蛋白質(zhì)提取的原理是通過細(xì)胞破碎和分離蛋白質(zhì)與其他細(xì)胞成分的方法，從而得到純凈的蛋白質(zhì)。提取蛋白質(zhì)是利用蛋白質(zhì)的物理和化學(xué)性質(zhì)進(jìn)行分離和提取。蛋白質(zhì)的物理性質(zhì)包括分子量、電荷、溶解性等,化學(xué)性質(zhì)包括氨基酸序列、親水性、親油性等。在細(xì)胞破碎法中，機(jī)械或化學(xué)方法破壞細(xì)胞膜,釋放細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)。在溶解法中，蛋白質(zhì)溶解在緩沖液中，然后通過離心等方法分離蛋白質(zhì)。
 

　　機(jī)械法裂解
 

　　很多情況下，微生物分泌蛋白質(zhì)到培養(yǎng)基中，提取分離蛋白質(zhì)就比較容易， 而對于細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)(比如酵母產(chǎn)生的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶，黑曲霉產(chǎn)生的過氧化氫酶及葡萄糖氧化酶等)，則需要采用機(jī)械方法或非機(jī)械方法對細(xì)胞進(jìn)行有效的破碎。在實驗室內(nèi)已經(jīng)有不少破碎細(xì)胞的方法，常用的機(jī)械方法包括超聲波法、高壓勻漿法、高速珠磨法等。選擇細(xì)胞的破碎方法要考慮破碎的目的和破碎對象的類型。如果為了定量獲得細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)以進(jìn)一步研究，破碎收率就很重要。細(xì)胞的類型、大小、形態(tài)、生長條件、細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)及環(huán)境溫度、pH等因素都會造成細(xì)胞對不同破碎方法的敏感度也不同?？梢愿鶕?jù)實驗及以往的經(jīng)驗來選擇破碎方法，但要注意破碎不能影響到目的蛋白產(chǎn)物的活性，在細(xì)胞的破碎過程中盡量避免將產(chǎn)物暴露在不利的條件下。破碎過程中，常常產(chǎn)生比較多的熱量，需要預(yù)先冷卻樣品(最好到4℃)，在破碎過程中，應(yīng)盡可能保持低溫。另外，一旦細(xì)胞被破碎，就失去了代謝調(diào)節(jié)機(jī)制的控制，目的蛋白就會受蛋白酶的作用，因此需要迅速提取目的蛋白，或加入抑制劑，或降溫以減小蛋白酶的作用。
 

　　化學(xué)法和酶法裂解
 

　　一些細(xì)菌裂解試劑中的活性成分是非離子去污劑或兼性離子去污劑, 這些試劑的功能是裂解細(xì)胞膜和細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，削弱細(xì)胞的結(jié)構(gòu)以便于通過滲透沖擊、凍融、噬菌體胞壁質(zhì)酶或雞卵白胞壁質(zhì)酶的酶解裂解細(xì)胞。除了極少數(shù)個例以外，革蘭氏陽性菌通過胞壁質(zhì)酶單獨(dú)處理就能夠輕易裂解 。革蘭氏陰性菌很難僅通過胞壁質(zhì)酶單獨(dú)作用裂解，因為其外側(cè)磷脂雙分子層必須首先經(jīng)過可滲透化處理 以暴露出其肽聚糖，細(xì)胞壁才能被酶降解。Tris 緩沖液中添加的 EDTA 能夠使雙分子層中大約 50% 的多聚陰離子脂多糖 暴露出來。酵母比細(xì)菌更加難以裂解。它們致密而復(fù)雜的細(xì)胞壁占細(xì)胞干重的 25%。典型的成分是通過共價鍵、二硫鍵、氫鍵和疏水作用力相互交聯(lián)的葡聚糖類、纖維素、甘露糖蛋白和殼多糖。為了較為高效地裂解細(xì)胞, 酵母菌應(yīng)該在對數(shù)生長晚期和穩(wěn)定生長早期收集，因為進(jìn)入穩(wěn)定生長期時間越長的酵母菌的細(xì)胞壁越厚，而且出芽酵母菌的細(xì)胞壁上也會出現(xiàn)密集的芽痕或芽體。可以在裂解試劑之中添加蛋白酶抑制劑, 也可以采用蛋白酶缺陷的菌株來表達(dá)蛋白質(zhì)。相比較機(jī)械法和化學(xué)法而言，酶法處理微生物細(xì)胞使之裂解并降低裂解物的黏度有幾個顯著的優(yōu)點(diǎn): 水解酶對目標(biāo)細(xì)胞的細(xì)胞壁成分具有高度特異性, 它們作用溫和，不產(chǎn)生剪切力; 不會導(dǎo)致高溫或氧化等作用的破壞; 操作過程中不需要特殊的專用器械。酶法處理細(xì)胞、提取蛋白質(zhì)可以與機(jī)械裂解法相結(jié)合來提高目標(biāo)蛋白質(zhì)釋放的選擇性，提高提取物的產(chǎn)量和獲取速率，減小對產(chǎn)品的損傷，降低黏度以利于下游操作。Zymolase 和葡聚糖酶類溶細(xì)胞酶 (lyticaseglucanase) 是對于酵母菌細(xì)胞裂解及酵母原生質(zhì)體的獲得方面非常有用的酶類。
 

　　微生物蛋白質(zhì)提取
 

　　1從菌液中提取總蛋白1、配制裂解液(pH 8.5-9.0)：50 mM Tris-HCl，2 mM EDTA, 100 mM NaCl，0.5% Triton X-100，調(diào)pH值至8.5-9.0備用；用前加入100 μg/ml 胞壁質(zhì)酶，1μl/ml 的蛋白酶抑制劑PMSF。該裂解液用量為10-50ml 裂解液/1g濕菌體。2、將40ml 菌液在12000g，4℃下離心15分鐘收集菌體，沉淀用PBS懸浮洗滌2遍，沉淀加入1ml裂解液懸浮菌體。3、超聲粉碎，采用300w，10s超聲/10s間隔，超聲20min，反復(fù)凍融超聲3次至菌液變清或者變色。4、1000g離心去掉大碎片，上清可直接變性后PAGE電泳檢測，或者用1% SDS溶液透析后凍存。3.2從Trizol裂解液中分離總蛋白1、Trizol溶解的樣品研磨破碎后，加氯仿分層，2-8℃下10000g離心15min，上層水相用于RNA提取，體積約為總體積的60%。2、用乙醇沉淀中間層和有機(jī)相中的DNA。每使用1ml Trizol加入0.3ml無水乙醇混勻，室溫放置3min，2-8℃不超過2000g離心5min。3、將上清移至新的EP管中，用異丙醇沉淀蛋白質(zhì)。每使用1ml Trizol加入1.5ml異丙醇，室溫放置10min，2-8℃下12000g離心10min，棄上清。4、用含有0.3M 鹽酸胍的95%乙醇洗滌。每1ml Trizol加入2ml洗液，室溫放置20min， 2-8℃下7500g離心5min，棄上清，重復(fù)洗滌2次。最后加入2ml無水乙醇，渦旋后室溫放置20min，2-8℃下7500g離心5min，棄上清。5、冷凍干燥5-10min，1%SDS溶液溶解，反復(fù)吹打，50℃溫浴使其溶解，2-8℃下10000g離心10min去除不溶物。6、替代方案：將3中的酚醇上清液移至小分子量透析袋中，在2-8℃的1% SDS溶液中透析3次，1000g離心10min去除沉淀，上清可直接用于蛋白實驗。