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俊齊儀器設備（上海）有限公司
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閱讀：140發布時間：2023-1-17
反相色譜（RP-HPLC）是一種非常強大的分離模式，從小的有機酸到150 KDa的蛋白，它被應用于無數化合物的分析分離工作中。但是反相色譜有一個局限，就是在分析水溶性好（也就是親水性強）的分析物時保留較弱，這時我們往往需要設計增加流動相中水相的比例以增加極性分析物和疏水固定相之間的作用，從而增加極性化合物的保留。分析物的極性越大，流動相中水的比例也需要更高。但是當我們在純水相或接近純水相的流動相條件下長時間使用常規C18時，會發現分析物的保留時間會發生逐漸或者突然變小而出現結果不能重現的問題。所以色譜研究人員經常有以下的問題：
“為什么純水條件下會發生這個現象？"
“流動相中水的比例到底多高是可以接受的？"
“但是為什么又有一些C18固定相的反相色譜柱在純水條件下沒有保留時間減少的問題？"
為什么純水條件下會發生這個現象？
對于常規的C18（或其他疏水固定相）色譜柱在99%水的流動相中會逐漸或突然減少分析物的保留時間這個現象，早期的解釋是鍵合在硅膠表面的C18固定相在純水條件下的改變了C18的空間排布，即由原來的垂直在硅膠表面變成了平躺在硅膠的表面，也就是常說的“固定相塌陷"（Phase collapse），如圖1。固定相平躺在硅膠表面就減少了固定相和分析物之間的作用，分析物的保留時間也就因此減少。
圖1 (a)在水/甲醇中的固定相狀態；(b)純水相中的固定相狀態
到了90年代的后期，實驗證據的出現讓許多研究者接受了另一種新的理論解釋，也就是保留時間的減少實際是由于固定相的顆粒孔“去濕“（Dewetting）現象所造成。也就是說水相和疏水的固定相表面之間產生高的表面張力，因此流動相會很容易被逐出布滿疏水固定相的填料的多孔空間。如果顆粒的孔內不再有液體，固定相和分析物相互接觸的機會也減少了，進而造成兩者之間相互吸引力的減少，分析物的保留時間自然縮短。實驗證實當C18的固定相由高有機溶劑突然轉換99%水溶劑時，流動相在色譜柱中的體積明顯的降低，而流動相在色譜柱內的體積減低的幅度和分析物的保留時間的減少有著密切關聯。
圖2 （a）“濕潤"狀態；(b)“去濕"狀態
影響溶劑被逐出顆粒孔外有以下幾個主要因素：顆粒的孔徑大小，固定相的種類，柱溫，以及柱壓（對于柱壓這個因素，我們也可以說“去濕"與顆粒大小和流速有關）。Young和 Laplace的方程式（如下）經常用來解釋不同參數影響去濕的現象。這個方程式提供了以下幾個參數的關系：進入毛細管所需的壓力(P)，液體在表面接觸的角度(θ), 液體的表面張力(γ)，和毛細管的半徑(r)。
因為水在鍵合疏水固定相的硅膠表面接觸的角度大于90°，所以要將水擠進到硅膠顆粒的孔中是需要正壓。在正常的液相分析中，將水推進硅膠顆粒孔中的壓力是大于流動相經過整支色譜柱硅膠表面所需的壓力。所以當柱壓突然停止時，孔內壓力大于孔外壓力，水的流動相就自然由疏水固定相的顆粒孔內被排出來。當再使用這支色譜柱時而顆粒孔內沒有液體時，固定相和分析物接觸的體積大大的減少，分析物的保留時間自然就很明顯的減少。但是當固定相變得比較不疏水時，水和硅膠表面的接觸角度就會減少。一旦當接觸角度小于90°, 由上面的方程式得到進入毛細管所需的壓力（P）就成為負數，表示孔外壓力大于孔內壓力，流動相會自動地進入顆粒孔內。這就是我們說的“濕潤"（wetting）顆粒孔。上面的方程式也同時告訴我們顆粒孔徑的大小（r）也會影響到壓力，當孔徑越小，要將流動相推入孔內所需要的壓力也就越大。
雖然上面方程式提供一個很好的理論解釋，但是因為硅膠孔的結構并非很對稱，顆粒大小也不是很均勻，而且孔內的固定相也包含了沒有鍵合的游離硅醇基團，不同密度的固定相（例如C18）和被封端的硅醇基團（例如TMS封端）。所以當我們希望準確回答“流動相中的水的比例到底多高是太高？"時，色譜方面的文獻往往無法給出具體的答案，但是它們給了我們非常有用的數據來判斷趨勢。比如 Bidlingmeyer 和 Broske發現對于一種常規的C18色譜柱，如果孔徑大小是80 ?時，在純水流動相條件下保留時間大幅減少（約80%），而孔徑是150 ?時，對保留時間則沒有影響。如果是帶有苯基的固相相，即使是80 ?的孔徑，保留時間也毫無影響。
流動相中水的比例到底多高是可以接受的？
由于每個廠家C18色譜柱都不盡相同，而且有很多不同的參數會影響色譜柱的耐水性能，很難有一個指標可以很容易的來決定到底某一種色譜柱能承受多少的水，所以方法就是直接測試來決定到底流動相含有多少水是太多。以下是簡易的實驗：
（1）首先使用高甲醇或是乙腈的溶劑平衡色譜柱，讓顆粒孔內保持“濕潤"（wetting）的情況，一般使用20倍柱體積的流動相以一般流速沖洗色譜柱就足夠了；
（2）然后準備好的含水流動相（或是純水）和分析樣品（含兩種或者三種化合物的混合物），需要確保樣品在這種流動相條件下可以得到合理的保留時間，接下來每一分鐘進樣一次一直到色譜柱達到平衡，保留時間穩定后幾分鐘，然后停泵；
（3）10分鐘后，重新啟動泵，再度進樣并比較流動相停止前與后的保留時間。如果有明顯的減少，就表示在這個比例的富水流動相有嚴重的“去濕"（Dewetting），這種色譜柱就必須避免在這個比例的水（或更高）的流動相條件下操作。
圖3是使用兩種不同的C18柱所得到測試的結果。種是常規的C18柱，第二種是帶有親水性的C18柱（AQ-C18）。兩者都是硅膠基質的C18柱，但是AQ-C18固定相的設計是避免在純水條件下產生“去濕"（Dewetting）的現象，也就說AQ-C18可以在純水下操作。在停止流動相的前和后的10分鐘內每一分鐘進樣一次，而中間將流動相停止10分鐘。一開始時，保留時間比較短，主要是色譜柱還沒有由50/50有機相/水到99%的水達到平衡。一旦達到平衡，可以看到兩種C18色譜柱的保留時間很相近。但是將流動相停止10分鐘后的進樣，就看到非常不同的結果。常規C18的保留時間大幅減少（減少75%），而AQ-C18 的保留時間基本沒有太大變化。
圖3 停泵10 min前后保留因子的測定
如果發現反相柱因為儲存太久造成保留時間明顯減少時，很可能是因為硅膠顆粒柱床干涸，也就是已經“去濕"（Dewetting）。這種“去濕"并不意味著柱子發生不可逆的損壞，我們可以嘗試使用有機相比較高的流動相沖洗色譜柱，例如50/50的乙腈/水，以低流速沖5-10分鐘。一旦流動相能重新“濕潤"（wetting）顆粒的孔，色譜柱基本就可以恢復到原來的保留情況。如果我們在使用常規C18柱開發時，想要確定是否存在由于使用的流動相中水的比例太高而使色譜柱“去濕"（Dewetting）的風險時，可以利用上述的方法測試含不同比例的水的流動相來快速鑒定 。
為什么有一些C18固定相的反相色譜柱在純水條件下沒有保留時間減少的問題？
如果想避免這種情況，另一種選擇是使用極性基團修飾過的C18色譜柱，這類色譜柱允許在99% 水相的條件下操作。使用帶有極性基團的C18色譜柱對分析極性化合物還有另一重的優勢，那就是這類色譜柱除了提供C18的疏水作用外，還有其他的極性作用力，可以增加對極性化合物的保留。因為有了可以在純水條件下操作和極性作用力的雙重優勢，帶有極性的C18柱也就越來越多使用在分析極性化合物。下表是部分可以在純水下操作的反相色譜柱供參考。其他不在表中可在純水下操作的色譜柱，可以咨詢不同廠家。
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