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乳酸菌微膠囊保護一直是食品科學與工程領域的研究熱點，但由于乳酸菌對酸、溫度、氧和外力等環境因素高度敏感,以及乳酸菌菌株個體差異性較大其有效包埋方法仍在探索中¹。內源乳化法是近年來興起的種海藻酸鈉微膠囊制備方法,已陸續成功包埋乳酸菌、胰島素、活性酶、卡介苗、胰島細胞、微藻等生物活性組分,該方法具有粒徑可控、工藝易放大等優點,且制備過程中使用的都是無毒試劑和溶劑,因而內源乳化法可用來制備物理特性可控的乳酸菌微膠囊².

海藻酸鈉(ALG),是由a-L-古羅糖醛酸(G）和β-D-甘露糖醛酸(M)兩種單體通過(1-4)糖苷鍵連接形成的線性嵌段共聚高分子,免疫原性低、生物相容性好,常用于包埋乳酸菌。但單一海藻酸鈉對乳酸菌的保護效果一般,復合壁材能填充海藻酸鈉凝膠的多孔結構,可有效提高微膠囊對乳酸菌的保護效果^l。魔芋葡甘聚糖(KGM),是主鏈由D-甘露糖和D-葡萄糖以β-1，4糖苷鍵鏈接的雜多糖,來源于中國特色經濟作物魔芋,因其具有良好的成膜、熱溫度、酸穩定等特性,而作為微膠囊壁材來包埋核酸³、胰島素⁴、酶⁵、精油⁶等生物活性物質,同時廣泛應用于食品加工中,以改善食品口感、硬度和色澤等品質^7-8。Wang等比較了AG和 ALG-KGM胰島素微膠囊的各項特性,發現添加KGM使得電鏡下微膠囊結構更加緊實,同時提高了微膠囊中胰島素的載藥量⁴.因而,本文將考察AG與KGM復配微膠囊對乳酸菌的保護效果。

另一方面,KGM分子量可能會對 ALG-KGM微膠囊對乳酸菌保護效果產生重大影響。Yang等添加少量吐溫80,將不同粘度的KGM水解物做壁材,通過乳化噴霧干燥過程制備甜橙油微膠囊,研究發現中等粘度(200 mPa） KGM水解物對甜橙油包埋率⁶。高Chen等通過小鼠實驗,發現KGM和KGM水解物均大大提高了小鼠腸道短鏈脂肪酸含量、雙歧桿菌數目而與原始KGM相比,KGM水解物益生效果更優⁹.因而,本文進一步考察了KGM分子量對 ALG-KGM微膠囊保護乳酸菌效果的影響。

1材料與方法

1.1原料

11.1菌種

嗜酸乳桿菌( L. acidophilus CGMCCl268購自

中國普通微生物保藏管理中心

1.1.2培養基

MRS培養基:菌萄糖20蛋白胨10g,牛肉浸膏10g,酵母浸膏5g醋酸鈉5g磷酸氫二鉀2g

檸檬酸三銨2g、MgSO_4.7H₂O 0.58g、MnSO₄  4H₂O 0.25g吐溫80 1m水1L pH 6.8-7.0

13主要試劑

AIG由美國 FMC BioPolymer公司提供;KGM由武漢清江魔芋制品有限公司提供;納米級CaCO3為分析純,購自中國上海振欣試劑廠;3號膽鹽、胃蛋白酶(3000Umg)和其它試劑均為分析純,購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.4主要溶液

模擬胃液(SGJ):NaCl02%(mm),用鹽酸調pH至2.0,滅菌后,加入一定量的胃蛋白酶(032%m/m);

膽鹽溶液(BS):磷酸一氫鉀068%(m),膽鹽1.09%(mm),用氫氧化鈉調pH至68,滅菌備用;

磷酸鹽-氯化鈉緩沖溶液(PS):p7.0,磷酸氫二鈉磷酸二氫鈉0.1M,氯化鈉09%mm),滅菌備用

1.2主要儀器設備

Mastersizer200(光粒度儀,英國馬爾文儀器有限公司; Haake Rheostress6000旋轉流變儀,美國Scientific公司;PIMR2100高速剪切乳化機,瑞士Kinematica公司;sxQ-1數顯直流無級調速攪拌器,鄭州長城科工貿有限公司;TGL20M臺式高速冷凍離心機,長沙平凡儀器儀表有限公司;HZws智能恒溫恒濕箱,無錫華澤科技有限公司。

1.3實驗方法

1,3.1菌體的收集

MRs培養基中,37℃下靜置培養嗜酸乳桿菌24h,冷凍離心10min(4℃、800g,棄上清,用無菌生理鹽水洗滌菌泥兩次后,重懸于無菌生理鹽水中。此時控制菌懸液細胞個數在10 CFU/ mL左右

1.3.2不同分子量KGM的制備

配制KGM溶膠(2%m/m,加入纖維素酶迸行酶解制備不同分子量的KGM,具體纖維素酶添加量見表1,在轉速為100r/mim的搖床中55℃下反應6h沸水浴中滅酶10min.

13.3乳酸菌微膠囊的制備

內源乳化法制備乳酸菌微膠囊的過程主要參照文獻中^10-11的方法,并在此基礎上有所改變。稱取一定量的AG、KGM和碳酸鈣粉末,緩慢加入水中,60℃下機械攪拌(250r/mim)3h配制含3%ALG,0.6%KGM和37.5mM碳酸鈣的混合液;取20mL上述混合液與10m菌體懸浮液,混合均勻;將其加入到含1%span的70mL大豆油中,300r/min攪拌15min形成油包水液滴;加入20mL大豆油(含0.18g冰醋酸,酸鈣摩爾比值為4),100r/min攪拌30min進行微膠囊固化;加入200mL PS溶液,靜置30min吸走上層油相,分液漏斗分層,棄去油層,待大部分油滴除去后,過濾得AIG-KGM微膠囊。AIG微膠囊制備過程中沒有添加0.6%KGM,其余條件與ALG-KGM微膠囊相同。

1.3.4 ALG-KGM乳酸菌微膠囊粒徑特性的測定

通過激光粒度分析儀( Marstersizel2000來測定微膠囊粒徑大小和粒徑跨度系數。用超純水做分散劑折光率、樣品折射率和吸收率分別設定為1.33、1.52、0.1。粒徑跨度系數=D(v,90)-D(v,10)/D(y,50)其中D(v,90),D(v,10)和D(v,50)份別代表直徑在90%,10%和50%處的微膠囊累積體積。

1.3.5 AIG-KGM乳酸菌微膠囊機械強度和粘彈性的測定

微膠囊機械強度和粘彈性均在 Haake RheoStress 6000旋轉流變儀進行測定,采用平行板鈦合金轉子P60 TiL,實驗溫度為25.0±0.1℃。機械強度通過壓迫試驗來測定:取3g微膠囊平鋪于平行板上,Gap初始間距設為1mm結束距離設為0.15m以0.005mm/s速度下壓,采集下壓過程中的法向應力值。微膠粘彈性以其彈性儲能模量(G)和粘性損耗模量(G")來表征,通過應力應變掃描實驗和小振幅動態頻率掃描驗來進行測定:應力應變掃描實驗確定線性粘彈區范圍,頻率設定為1H,應變設定為0.19%-1000%;小振幅動態頻率掃描:測定體系的彈性儲能模量(G)和粘性損耗模量(G")隨角頻率ω的變化,掃描頻率范圍為0.1~100rad/s,設定對數模式采集數據點。

1.3.6乳酸菌包埋率的測定

乳酸菌包埋率的測定主要參照文獻中^10-11的方法。將1g微膠囊加入到9g PS容液中,用高速均質機(1000r/min.30S)破碎該微膠囊混合液,搖床中37℃、100r/min下搖晃30min取1mL該破碎混合液,用PS溶液稀釋后,涂布于MRS培養基上,37℃、厭氧條件下培養48h后計數,計算乳酸菌活細胞包埋數。同時,取包埋前菌懸液,稀釋、涂布平板、培養計數,計算細胞總菌數。乳酸菌包埋率(EY)可表示為:

1.3.7模擬胃液菌體存活率的測定

模擬胃液菌體存活率的測定主要參照文獻中^10-11的方法。將1g微膠囊加入到9g模擬胃液(SGJ)中,搖床中37℃、100r/min下溫育2h;用高速均質機(1000r/min,30s)破碎該微膠囊混合液;取1mL破碎混合液于4℃、10000g的條件下冷凍離心20min棄去上清液,加入1mLPs溶容液振蕩均勻,稀釋、涂布平板、培養計數,計算模擬胃液乳酸菌存活數。同時,以生理鹽水替換模擬胃液,其它步驟不變,計算空白對照中菌體存活數。模擬胃液菌體存活率可表示為:

1.3.8膽鹽菌體存活率的測定

膽鹽菌體存活率的測定主要參照文獻中^10-11的方法。將1g微膠囊加入到9g膽鹽溶液(BS)中,搖床中37℃100r/min下溫育0.5h后;用高速均質機(1000r/min,30s)破碎該微膠囊混合液;取1mL破碎混合液于4℃、10000g的條件下冷凍離心20min,棄去上清液,加入1mL Ps溶液振蕩均勻,稀釋、涂布平板、培養計數,計算膽鹽溶液乳酸菌存活數。同時,以生理鹽水替換膽鹽溶液,其它步驟不變,計算空白對照中菌體存活數。膽鹽菌體存活率可表示為

1.3.9數據分析與處理

實驗數據差異顯著性用SPSS17.0軟件進行分析,ANOVA程序用于方差分析,當p0.05時認為平均值之間有顯著差異。回歸分析使用 Excel2007中的“數據分析回歸”來確定模型方程,相關系數R表示變量之間的密切關系,R越接近1,表明變量之間的線性關系越密切。

2結果與討論

纖維素酶是復合酶,主要由3種酶組成:內切β-14葡聚糖酶、外切β-1,4-葡聚糖酶和β葡萄糖苷酶¹²。纖維素酶法降解KGM的主要原理為:利用內切B-1，4-葡聚糖酶對KGM中的B-1，4-葡萄糖健的破壞作用,將KGM切割成許多短鏈。該方法簡單易行,在文獻中多次報道⁶。由表1可以看出,通過設定不同的酶底比梯度,成功將KGM從起始分子量8.11×10⁵降解到8.03×10³,且各組分間分子量成梯度下降的趨勢。為區分各組分區別,將各組分由分子量從大到小的順序命名為KGM-0、KGM-1、KGM-2、KGM3、KGM-4.

如表2所示,AG微膠囊平均粒徑為309pm,當向AG中添加KGM后, ALG-KGM微膠囊粒徑顯著增加至412489μm,但不同分子量 KGM-ALO微膠囊間的粒徑差異不顯著。同樣地,與AG微膠囊相比, ALG-KGM微膠囊粒徑跨度系數顯著增加,KGM分子量對 KGM-ALG微膠囊間的粒徑跨度系數影響不顯著。Sila等利用內源乳化法制備胰島素微膠囊,同樣得到了復配微膠囊粒徑和粒徑跨度系數均大于單一壁材微膠囊的實驗結果¹³.

2.3微膠囊的機械強度

通過壓迫實驗,在旋轉流變儀上測定了各微膠囊在間距0.15mm處的法向應力值,以此來表征微膠囊機械強度。如圖1所示,添加KGM后,所有 ALG-KGM微膠囊的機械強度比AG微膠囊都有所増加,而隨著KGM分子量的減小, ALG-KGM微膠囊機械強度呈現先增大后減小的變化規律,具體微膠囊機械強度排序如下:KGM-2>KGM-1>KGM-3>KGM-0>KGM-4>ALG。

2.4微膠囊的粘彈性

通過小振幅動態掃描實驗,測定了微膠囊在角頻率0.1~100rad/s范圍內的彈性儲能模量(G)和粘性損耗模量(G"),來表征微膠囊粘彈性。如圖2所示,對6種乳酸菌微膠囊而言,在角頻率掃描范圍內,G均大于G",同時G基本保持恒定,這是彈性體物質的典型特征,也證明了本文中的微膠囊己凝膠化。為清晰比較6種乳酸菌微膠囊的粘彈性大小,特將w=1nad/s時的微膠囊G和G值做成表格,如表3所示。加入KG迅M后,復配微膠囊粘彈性均增大;而隨著KGM分子量的減小,ALG-KGM微膠囊的粘彈性呈現出先增大后減小的趨勢,這與 ALG-KGM微膠囊機械強度的變化趨勢相同.

2.5微膠囊的乳酸菌包埋率

表4中列出了各微膠囊乳酸菌包埋率,可以看出,添加KGM顯著提高了微膠囊的菌體包埋率。這可能與KGM的粘附性相關,Wang等報道了向AIG添加KGM顯著提高了微膠囊中胰島素載藥量⁴,與本文結果相似。另外,KQM分子量也影響了 ALG-KGM微膠囊的菌體包埋效果,隨著KGM分子量減小,微膠囊菌體包埋率呈現先增加后減小的趨勢。同樣地,Yang等以KGM水解物為壁材,通過乳化-噴霧干燥制備甜橙油微膠囊,研究發現中等粘度KGM水解物的包埋率高⁶。這可能是由于高分子量的KGM極大地增加了ALG溶膠粘度,不利于乳化液滴形成,低分子量的KGM失去了成膜能力,不能將乳酸菌有效包裹在微膠囊內.

表4乳酸菌微膠囊的包埋率

2.6 微膠囊模擬胃液菌體存貨率

如表5所示:通過微膠囊包埋,模擬胃液菌體存活率提高了10個數量級,/在酸脅追條件下較好地保護了乳酸菌與AG微膠囊相比, ALG-KGM微膠囊模擬胃液菌體存活率都有一定程度的提高;KGM分子量影響了 ALG-KGM微膠囊的模擬胃液菌體存活率,隨著KGM分子量減小,微膠囊菌體包埋率呈現先增加后減小的趨勢。由于機械強度是一項重要的微膠囊物理特性,故進一步對微膠囊模擬胃液菌體存活率和機械強度進行回歸分析。如圖3所示,通過Excel2007進行一元線性回歸分析,得到微膠囊模擬胃液菌體存活率與機械強度的線性回歸方程為y=1.194x+3412,其中,相關系數R=0.96207R(0.05,4)0.81140,F49745,P0.002<005,表明該回歸方程顯著且微膠囊模擬胃液菌體存活率與機械強度正相關。與本文結果類似, Sandoval等報道了在酸奶和模擬胃液中,Lb.casei的存活率與微膠囊機械強度正相關¹⁴。這主要是由于微膠囊機械強度越大,結構越緊實,溶脹越小,微膠囊對乳酸菌的酸保護效果越好。

膽鹽是人體消化系統中的重要物質,具有抑菌性,故我們通過測定膽鹽菌體存活率來表征微膠囊對乳酸菌的保護作用。如表6所示:與自由菌相比,微膠囊膽鹽菌體存活率提高了10³個數量級,說明微膠囊包埋可有效阻礙膽鹽對乳酸菌的傷害;與ALG微膠囊相比, ALG-KGM微膠囊膽鹽菌體存活率都有一定程度的提高;KGM分子量影響了 ALG-KGM微膠囊的膽鹽胃液菌體存活率,隨著KGM分子量減小,微膠囊菌體包埋率呈現先增加后減小的趨勢。同樣地,我們對微膠囊膽鹽菌體存活率和機械強度進行了回歸分析。如圖4所示,通過 Excel200進行一元線性回歸分析,得到微膠囊膽鹽菌體存活率與機械強度的線性回歸方程為y=453×642,其中,相關系數R=096412R(005,4)0.81140,F=52752,P=0.02<005,表明該回歸方程顯著且微膠囊膽鹽菌體存活率與機械強度正相關。

綜合表5和表6中的實驗結果,我們可以看出:1)在模擬胃液和膽鹽中,KGM與AIG復配后提高了微膠囊對乳酸菌的保護效果,這與Zou等人采用相冋內源乳化法包埋乳酸菌的研究結果相同,這是由于復合壁材能填充海藻酸鈉凝膠的多孔結構,使海藻酸鈉結構更結實、更穩定;2)KGM分子量影響了AG-KGM微膠囊對乳酸菌的保護效果,這可能是由于不同分子量KGM與ALG相互作用方式不同造成的。如圖5所示,高分子ALG易于KGM發生相分離微膠囊機械強度較弱;低分子ALG片段狀存在,與AG相互作用較弱,微膠囊機械強度較弱;中等分子KGM,與AG相容性較好,可發生部分纏結,從而具有較高的機械強度.

3結論

本研究以不同分子量的KGM與ALG復配,通過內源乳化法制備乳酸菌微膠囊,表征了微膠囊粒徑特性、機械強度、粘彈性等物理特性,并測定了微膠囊的乳酸菌包埋率、模擬胃液菌體存活率、膽鹽菌體存活率等指標。結果發現:ALG與KGM復配,增大了微膠囊粒徑、機械強度、粘彈性、乳酸菌包埋率、模擬胃液菌體存活率及膽鹽菌體存活率,提高了微膠囊對乳酸菌的保護效果;同時,KGM分子量大小影響了 ALG-KGM微膠囊對乳酸菌的保護效果,其中中等分子量 KGM-ALG微膠囊具有高的乳酸菌包埋率、模擬胃液菌體存活率和膽鹽菌體存活率,這可能是與忑不同分子量KGM與ALG作用方式不同造成的.