熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)步驟：
①取凍存已裂解的細(xì)胞，室溫放置5分鐘使其*溶解。
②兩相分離 每1ml的TRIZOL試劑裂解的樣品中加入0.2ml的lvfang，蓋緊管蓋。手動(dòng)劇烈振蕩管體15秒后，15到30℃孵育2到3分鐘。4℃下12000rpm離心15分鐘。離心后混合液體將分為下層的紅色酚lvfang相，中間層以及無色水相上層。RNA全部被分配于水相中。水相上層的體積大約是勻漿時(shí)加入的TRIZOL試劑的60%。
③RNA沉淀 將水相上層轉(zhuǎn)移到一干凈無RNA酶的離心管中。加等體積異丙醇混合以沉淀其中的RNA，混勻后15到30℃孵育10分鐘后，于4℃下12000rpm 離心10分鐘。此時(shí)離心前不可見的RNA沉淀將在管底部和側(cè)壁上形成膠狀沉淀塊。
④RNA清洗 移去上清液，每1mlTRIZOL試劑裂解的樣品中加入至少1ml的75%乙醇(75%乙醇用DEPCH2O配制)，清洗RNA沉淀。混勻后，4℃下7000rpm離心5分鐘。
⑤RNA干燥 小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室溫空氣中干燥5-10分鐘。
⑥溶解RNA沉淀 溶解RNA時(shí)，先加入無RNA酶的水40μl用槍反復(fù)吹打幾次，使其*溶解，獲得的RNA溶液保存于-80℃待用。 1)紫外吸收法測定先用稀釋用的TE溶液將分光光度計(jì)調(diào)零。然后取少量RNA溶液用TE稀釋(1:100)后，讀取其在分光光度計(jì)260nm和280nm處的吸收值，測定RNA溶液 濃度和純度。

客戶只需提供樣品和待檢測基因名稱即可。由我們提取RNA，設(shè)計(jì)并合成引物，完成熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)以及后續(xù)數(shù)據(jù)分析，提供實(shí)驗(yàn)報(bào)告給您。

產(chǎn)品特點(diǎn):
靈敏度高：可檢測個(gè)位拷貝數(shù)的基因
特異性高：有效避免非特異性擴(kuò)增的出現(xiàn)
穩(wěn)定性高：復(fù)孔間差異小，實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)性強(qiáng)
擴(kuò)增性能優(yōu)：擴(kuò)增效率高，熒光信號(hào)強(qiáng)

實(shí)時(shí)定量PCR：
①β-actin陽性模板的標(biāo)準(zhǔn)梯度制備 陽性模板的濃度為1011，反應(yīng)前取3μl按10倍稀釋（加水27μl并充分混勻）為1010，依次稀釋至109、108、107、106、105、104，以備用。
②反應(yīng)體系如下：
標(biāo)準(zhǔn)品反應(yīng)體系
序號(hào)  反應(yīng)物  劑量
1   SYBR Green 1 染料  10μl
2  陽性模板上游引物F  0.5μl
3  陽性模板下游引物R  0.5μl
4  dNTP  0.5μl
5  Taq酶  1μl
6  陽性模板DNA  5μl
7  ddH2O  32.5μl
8  總體積  50μl
輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心。

基因反應(yīng)體系：
序號(hào)  反應(yīng)物  劑量
1  SYBR Green 1 染料  10μl
2  內(nèi)參照上游引物F  0.5μl
3  內(nèi)參照下游引物R  0.5μl
4  dNTP  0.5μl
5  Taq酶  1μl
6  待測樣品cDNA  5μl
7  ddH2O  32.5μl
8  總體積  50μl
輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心。
③制備好的陽性標(biāo)準(zhǔn)品和檢測樣本同時(shí)上機(jī)，反應(yīng)條件為：93℃　2分鐘，然后93℃ 1分鐘，55℃ 2分鐘，共40個(gè)循環(huán)。
PCR特異性：
1.primers design
這是重要的一步。理想的，只同目的序列兩側(cè)的單一序列而非其它序列退火的primer要符合下面一些條件：
1)足夠長，18～24bp，以保證特異性，當(dāng)然，不是說越長越好，太長的primer同樣會(huì)降低特異性，并且降低產(chǎn)量；
2)GC%，40%~60%；
3)5'端和中間序列要多GC，以增加穩(wěn)定性；
4)避免3'端GCrich，個(gè)BASE不要有GC，或者5個(gè)有3個(gè)不要是GC。
5)避免3'端的互補(bǔ)，否則，容易造成DIMER；
6)避免3'端的錯(cuò)配；
7)避免內(nèi)部形成二級(jí)結(jié)構(gòu)；
8)附加序列(RT site，Promoter sequence)加到5'端，在算Tm值時(shí)不算，但在檢測互補(bǔ)和二級(jí)結(jié)構(gòu)要加上它們；
9)使用兼并primer時(shí)，要參考密碼子使用表，注意：生物偏好性，不要在3'端使用兼并primer，并使用較高的primer濃度(1μM～3μM)；
10)學(xué)會(huì)使用一種design software，PP5，Oligo6，DNA star，Vector NTI，Online design et al。

五95%Cantharidicacid,PP2AandPP1inhibitor

2-氨基二苯醚98%Endothall,proteinphosphatase2A(PP2A)inhibitor

苯基烯基醚98%RWJ-60475(AM)3,CD45tyrosinephosphataseinhibitor

苯基98%RK-682,proteintyrosinephosphatase(PTP)inhibitor

二苯二醚99%RK-682,proteintyrosinephosphatase(PTP)inhibitor

2-苯基炔97%Tyrphostin8,Tyrosinekinaseinhibitor

S-苯基代酯98%CinnGEL,Proteintyrosine1B(PTP1B)inhibitor

4-吡基吡鹽鹽98%BML-267,proteintyrosinephosphatase1B(PTP1B)inhibitor

4-苯基-3-代氨基脲98%U-75302,LeukotrieneB4BLT1receptorantagonist

鄰苯二酰亞胺99%BML-111,LipoxinA4agonist

苯色標(biāo)standardforGC,>99.5%(GC)BML-111,LipoxinA4agonist

苯98%SC-51322,EP1receptorantagonist

苯99%SC-51089,EP1receptorantagonist

苯分析標(biāo)準(zhǔn)品，≥99.8%(GC)SC-51089,EP1receptorantagonist

苯炔97%BAY-u9773,DualCysLT1andCysLT2antagonist
山羊皰疹病毒2型探針法熒光定量PCR試劑盒對(duì)苯二胺CPRepaglinide,SUR1/Kir6.2potassiumchannelblocker

(三氟基)三基硅烷96%Risedronatesodium,osteoclast-mediatedboneresorptioninhibitor

6-三氟基煙97%Tianeptinesodium,5-HTuptakefacilitator

1,2,4-苯三酚97%Tianeptinesodium,5-HTuptakefacilitator

4-苯胺鹽鹽98%Topiramate,GluR5kainatereceptorantagonist

2,4-二氟苯99%Zileuton,5-lipoxygenaseinhibitor

3,4-二氧基苯醛99%Nanchangmycin,Antibiotic

對(duì)苯二胺鹽鹽AR,98.5%Nanchangmycin,Antibiotic

間硝基苯醛98%Nanchangmycin,Antibiotic

鄰苯二酰90%Mycophenolatemofetil,MPDHinhibitor

鄰苯二酰98%Mycophenolatemofetil,MPDHinhibitor

對(duì)苯二酰99%Mycophenolatemofetil,MPDHinhibitor

對(duì)苯二酰97%Aztreonam,beta-lactamantibioticagent

對(duì)苯二胺鹽98%Aztreonam,beta-lactamantibioticagent

5-磺基水楊二水合物AR,≥99.0%Aztreonam,beta-lactamantibioticagent