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當(dāng)前位置:上海西格生物科技有限公司>>定量PCR試劑盒>>熒光定量PCR試劑盒>> 48T/96T萊氏無(wú)膽甾原體探針?lè)晒舛縋CR試劑盒
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產(chǎn)品型號(hào)48T/96T
品 牌其他品牌
廠商性質(zhì)生產(chǎn)商
所 在 地上海市
更新時(shí)間:2020-10-15 14:18:03瀏覽次數(shù):163次
聯(lián)系我時(shí),請(qǐng)告知來(lái)自 環(huán)保在線熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)步驟:
①取凍存已裂解的細(xì)胞,室溫放置5分鐘使其*溶解。
②兩相分離 每1ml的TRIZOL試劑裂解的樣品中加入0.2ml的lvfang,蓋緊管蓋。手動(dòng)劇烈振蕩管體15秒后,15到30℃孵育2到3分鐘。4℃下12000rpm離心15分鐘。離心后混合液體將分為下層的紅色酚lvfang相,中間層以及無(wú)色水相上層。RNA全部被分配于水相中。水相上層的體積大約是勻漿時(shí)加入的TRIZOL試劑的60%。
③RNA沉淀 將水相上層轉(zhuǎn)移到一干凈無(wú)RNA酶的離心管中。加等體積異丙醇混合以沉淀其中的RNA,混勻后15到30℃孵育10分鐘后,于4℃下12000rpm 離心10分鐘。此時(shí)離心前不可見(jiàn)的RNA沉淀將在管底部和側(cè)壁上形成膠狀沉淀塊。
④RNA清洗 移去上清液,每1mlTRIZOL試劑裂解的樣品中加入至少1ml的75%乙醇(75%乙醇用DEPCH2O配制),清洗RNA沉淀?;靹蚝?,4℃下7000rpm離心5分鐘。
⑤RNA干燥 小心吸去大部分乙醇溶液,使RNA沉淀在室溫空氣中干燥5-10分鐘。
⑥溶解RNA沉淀 溶解RNA時(shí),先加入無(wú)RNA酶的水40μl用槍反復(fù)吹打幾次,使其*溶解,獲得的RNA溶液保存于-80℃待用。 1)紫外吸收法測(cè)定先用稀釋用的TE溶液將分光光度計(jì)調(diào)零。然后取少量RNA溶液用TE稀釋(1:100)后,讀取其在分光光度計(jì)260nm和280nm處的吸收值,測(cè)定RNA溶液 濃度和純度。
產(chǎn)品名稱:萊氏無(wú)膽甾原體探針?lè)晒舛縋CR試劑盒
英文名稱:Acholeplasma laidlawii
貨號(hào):XG01P3217
分類:熒光定量PCR試劑盒
儲(chǔ)存條件:-20℃避光保存,避免反復(fù)凍融。
運(yùn)輸:低溫、避光,快遞免費(fèi)送貨上門。
實(shí)時(shí)定量PCR:
①β-actin陽(yáng)性模板的標(biāo)準(zhǔn)梯度制備 陽(yáng)性模板的濃度為1011,反應(yīng)前取3μl按10倍稀釋(加水27μl并充分混勻)為1010,依次稀釋至109、108、107、106、105、104,以備用。
②反應(yīng)體系如下:
標(biāo)準(zhǔn)品反應(yīng)體系
序號(hào) 反應(yīng)物 劑量
1 SYBR Green 1 染料 10μl
2 陽(yáng)性模板上游引物F 0.5μl
3 陽(yáng)性模板下游引物R 0.5μl
4 dNTP 0.5μl
5 Taq酶 1μl
6 陽(yáng)性模板DNA 5μl
7 ddH2O 32.5μl
8 總體積 50μl
輕彈管底將溶液混合,6000rpm短暫離心。
基因反應(yīng)體系:
序號(hào) 反應(yīng)物 劑量
1 SYBR Green 1 染料 10μl
2 內(nèi)參照上游引物F 0.5μl
3 內(nèi)參照下游引物R 0.5μl
4 dNTP 0.5μl
5 Taq酶 1μl
6 待測(cè)樣品cDNA 5μl
7 ddH2O 32.5μl
8 總體積 50μl
輕彈管底將溶液混合,6000rpm短暫離心。
③制備好的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品和檢測(cè)樣本同時(shí)上機(jī),反應(yīng)條件為:93℃ 2分鐘,然后93℃ 1分鐘,55℃ 2分鐘,共40個(gè)循環(huán)。
PCR特異性:
1.primers design
這是重要的一步。理想的,只同目的序列兩側(cè)的單一序列而非其它序列退火的primer要符合下面一些條件:
1)足夠長(zhǎng),18~24bp,以保證特異性,當(dāng)然,不是說(shuō)越長(zhǎng)越好,太長(zhǎng)的primer同樣會(huì)降低特異性,并且降低產(chǎn)量;
2)GC%,40%~60%;
3)5'端和中間序列要多GC,以增加穩(wěn)定性;
4)避免3'端GCrich,個(gè)BASE不要有GC,或者5個(gè)有3個(gè)不要是GC。
5)避免3'端的互補(bǔ),否則,容易造成DIMER;
6)避免3'端的錯(cuò)配;
7)避免內(nèi)部形成二級(jí)結(jié)構(gòu);
8)附加序列(RT site,Promoter sequence)加到5'端,在算Tm值時(shí)不算,但在檢測(cè)互補(bǔ)和二級(jí)結(jié)構(gòu)要加上它們;
9)使用兼并primer時(shí),要參考密碼子使用表,注意:生物偏好性,不要在3'端使用兼并primer,并使用較高的primer濃度(1μM~3μM);
10)學(xué)會(huì)使用一種design software,PP5,Oligo6,DNA star,Vector NTI,Online design et al。
氧?;交寤?5%Anti-ThyroidPeroxidase/TPOantibody[EPR5379]
基三苯基溴化膦98%Anti-ThyroidPeroxidase/TPOantibody[EPR5379]
代十六烷基吡一水合物98%Anti-ThyroidPeroxidase/TPOantibody[EPR5379]
基化吡98%Anti-14-3-3antibody[EPR6379]
基三苯基化膦97%Anti-14-3-3antibody[EPR6379]
氧酰基亞基三苯基膦98%Anti-14-3-3antibody[EPR6379]
氧酰基基三苯基溴化膦98%Anti-PDCD2antibody[EPR7158]
基三辛基化銨97%Anti-PDCD2antibody[EPR7158]
基三苯基溴化鏻98%Anti-PDCD2antibody[EPR7158]
(氧基基)三苯基化98%Anti-MCM2antibody[EPR3727]
基三苯基溴化膦99%Anti-MCM2antibody[EPR3727]
四基化銨98%Anti-MCM2antibody[EPR3727]
四基氟化銨,三水90%Anti-PDCD6/ALG-2antibody[EPR3260]
苯基三基98%Anti-PDCD6/ALG-2antibody[EPR3260]
四基化銨97%Anti-PDCD6/ALG-2antibody[EPR3260]
萊氏無(wú)膽甾原體探針?lè)晒舛縋CR試劑盒Fmoc-L-羥脯氨98%Anti-SIDT1antibody
組胺99%Anti-PIWIL1antibody
L-高苯氨98%RecombinantHumanC6orf134/TATprotein
組胺二鹽鹽98%RecombinanthumanFynprotein
L-羥脯氨酯鹽鹽98%RecombinanthumanMEKK2protein
DL-組氨98%RecombinantHumaniNOSprotein
組胺96%RecombinantHumanEZH2+EED+SUZ12+AEBP2+RBBP4(mutatedY646C)protein
D-高苯氨98%RecombinanthumanReninprotein
L-高苯氨酯鹽鹽BRRecombinantHumanPIK3R5protein
D-高苯氨酯鹽鹽BRRecombinantE.coliBirAprotein(Active)
L-高瓜氨BRRecombinantHumanPLA2G12Bprotein
DL-組氨鹽鹽BRRecombinantADAprotein
DL-高瓜氨BRRecombinanthumanTDP2protein
DL-異亮氨98%RecombinantHumanDPY30protein
DL-亮氨98%RecombinanthumanMLL+ASH2L+RBBP5+WDR5protein
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