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上海斯邁歐分析儀器有限公司
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用不同的酸調節流動相分離水楊酸中的雜質
2023-5-5 閱讀(384)
引 言低 pH 下 HPLC液相色譜儀 的優勢當分析有機酸時，ZORBAX StableBond SB-Aq 成為被經常選用的鍵合相。它在低 pH 下耐用且適用于含量很低或不含有機溶劑的流動相。它的鍵合相包括二異丙基側鏈基團對連接于硅膠表面的關鍵硅氧烷鍵的立體保護，使其在低 pH 下免于水解攻擊。這保證了在低 pH 下的長柱壽命和重現性。StableBondSB-Aq 最新應用實例包括分析果汁中發現的有機酸用不同的酸調節流動相分離水楊酸中的雜質應用[1和藥用化合物頭孢布坦的異構體[3]。在方法優化過程中，有機溶劑和流動相的 pH 是兩個可改變的關鍵參數。用乙腈改為用甲醇作有機相來改變選擇性的實例參見文獻 4。在一定的 pH 條件下，可電離的化合物將以帶電離子形式存在。對于可電離化合物苯甲酸而言，其在 pH3 和 pH 7 下的保留值及相應的色譜相互作用相差較大。在 pH 3 下，苯甲酸能夠很好保留（質子化），而在 pH 7 下，其流出靠近死體積（離子化）。象苯甲醇和硝基苯這樣的極性化合物，雖然是極性的但不發生電離，在 pH 變化時，保留值的變化小得多。
水楊酸的分析水楊酸也稱為 2-羥基苯甲酸，是幾種 β 羥基酸之一。它是治療座瘡、牛皮癬、皮膚硬結、雞眼和疣的護膚品中的關鍵添加劑。它通過使皮膚細胞更易于脫落以防毛孔堵塞來達到治療痤瘡的目的。這種對皮膚細胞的作用使水楊酸成為治療頭皮屑的幾種洗發精的活性成分。水楊酸也是除疣凝膠的活性成分。水楊酸鹽的藥用價值（主要是退熱）從古代起就廣為人知。這種無色晶狀有機酸也廣泛用于有機合成并作為植物激素發揮作用。這種物質存在于柳樹皮中，其名稱“salicylic acid"，即由柳樹的拉丁名 salix 衍生而來。
商品二氧化碳在高壓和高溫下發生 Kolbe-Schmitt 反應而制備。產物酸化后得到期望的水楊酸。主要反應示于圖 1。此外該反應也產生了幾種副產物，包括 2,5-二羥基苯甲酸、5-羥基-1,3-苯二羧酸、4-羥基苯甲酸這些化合物的結構及其通用名和 pKa 值列于圖 2。
典型的純度測定方法采用 5µm C18 色譜柱和含水-甲醇-冰醋酸（60 : 40 : 1）的酸性流動相。然而，這種方法只能檢測到三個主要雜質（4-羥基苯甲酸、4-羥基異苯二甲酸）。藥典方法也提出流動相組成的改變會導致洗脫順序的變化[7]。改變洗脫峰順序的原因是由于它們均為可電離化合物。當流動相的組成改變時，流動相的 pH 也隨之變化。本研究中，色譜上的變化由改變流動相所用添加劑的變化引起。通常采用常規濃度的 TFA、磷酸、乙酸和甲酸改善水楊酸和五種雜質間的分離。
實驗部分：LC 系統Agilent 1200 高分離度快速液相色譜系統（RRLC）（脫氣機、二元泵、多孔板自動進樣器和波長設于 220 nm 的二極管陣列檢測器）和StableBond SB-Aq，1.8 µm，4.6 mm x 50 mm 色譜柱（部件號827900-914）。二元梯度設為在 10 分鐘內甲醇（B 相）由 5% 增大到30%。甲醇購自 Burdick and Jackson（HPLC 級）。被測組分：• 水楊酸（SA）•4-羥基苯甲酸（4-HBA）• 2,5-二羥基苯甲酸（GA）• 5-羥基異苯二甲酸（5-HIPA）• 2-羥基馬尿酸（SG）上述樣品購自 Sigma Aldrich 或 ARCOS。加入 A 相的改性劑：純度 99%（pKa ＝ 0.23）• 磷酸 ACS 級（純度 85%）（pKa ＝ 2.12）• 冰乙酸，99%（pKa ＝ 3.8）• 甲酸 ACS 級 99%（pKa ＝ 4.8）磷酸、甲酸和乙酸購自 EM Science，TFA 購自 Sigma Aldrich。
結果與討論磷酸、乙酸和甲酸常用于控制 HPLC 流動相的 pH。將酸加入流動相的水相中是對緩沖液的一種簡捷且常常是有效的替代方法。此外，在快速梯度中使用小容積柱，快速分離高通量（RRHT）柱的小容積，使色譜柱在幾分鐘內即能達到平衡。圖 3 表明采用上述梯度，分別使用常規濃度的上述四種酸作改性劑進行的分離。由于起始分離建立在使用非揮發性磷酸基礎之上，通常認為不適用于質譜檢測器。TFA有時也不能用于 LC-MS，因為 TFA 能通過與被測物形成離子對而引起離子抑制。然而，在某些情況下通過將洗脫物在柱后和質譜檢測器前導入高濃度的其它酸中，可以將 TFA 從離子對締合物中置換出來。乙酸就是一種能很好地發揮這種作用而被用于此方法的酸。另一種離子對置換劑是 75% 丙酸 : 25% 異丙醇溶液。如圖 3 所示，TFA 和磷酸達到了好的分離效果，而在通常濃度下的甲酸和乙酸在好的分離條件下也只能分離其中的五個化合物。此外，在使用甲酸和乙酸的例子中，4-HBA 和 GA 的洗脫順序與使用 TFA和磷酸的情況相比發生了交換。這可能是由于 pH 的改變引起，然而要確定實際的變化機理需要進一步的研究工作。對于本研究而言，觀察到洗脫順序的改變就足夠了。圖 4 表明較高濃度酸對分離的影響。幾乎在所有的情況下都得到更尖銳的峰，SG 峰改善的程度最大。在圖3 中流動相的 pH 靠近所有化合物的 pKa值，所以，可以預期加入更多酸將會使溶液 pH 降至化合物不電離的程度，從而使峰形變得更好。
結論由于 RRHT 50 mm 色譜柱具有平衡時間和分析時間短的優點，使方法開發中進行幾種水相流動相改性劑的評價變得更為現實可行。更好的峰形和分離度可以簡單地通過用一種酸改性劑代替另一種酸改性劑而實現。再者，將 pH 降低（增大酸強度）至被測成分的pKa 以下將改善峰形。這種額外的方法開發在使用諸如 RRHT SB-Aq 等低容積短柱時顯著減少所需時間。在上述情況下，使用簡單的酸控制 pH，而此思路也能夠擴展用于評價不同的流動相緩沖液并優化緩沖液濃度。StableBond 色譜柱是低 pH 條件下應用的理想選擇。它們的柱化學性質和多種鍵合相，如 SB-Aq，提供了在低 pH 下的寬泛的選擇性、長壽命和重現性。
