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上海斯邁歐分析儀器有限公司
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液質聯用儀對尿樣中的阿片類化合物進行定量分析
2023-4-11 閱讀(132)
阿片類化合物是一類藥用化合物，通常用于鎮靜和緩解疼痛，既可能作為處方藥合法地獲得，也可能通過非法手段獲取。阿片類化合物的濫用常常會導致成癮。出于一些原因，包括治療藥物監測、在藥物影響下駕駛以及工作場所藥物測試等，通常會對這些化合物進行分析，尤其是對尿樣進行分析，因為尿樣易于獲得且樣品量充足。在法醫領域的檢測中，如果該類化合物的含量超過管制值，還需要提供另外的確證信息以證明它們的存在。三重串聯四極桿質譜儀能夠提供靈敏度最高的定量方式，即采集由被分析物母離子裂解產生的具有最高響應的子離子（定量離子）的相關信號。這種裂解轉變被稱為多反應監測（MRM）。其次，通過采集次高響應的子離子（定性離子）的附加信號，可以認為能夠獲得足夠的結構確證信息，尤其是當兩種子離子的信號比在校正標準品和未知樣品中保持一致時更是如此。使用液質聯用儀同時采集定量離子和定性離子的 MRM 信號能夠同時得到定量測定和結構確證結果。
安捷倫 MassHunter 軟件在其定量分析程序中包含用戶自定義離子比確證信息，如圖 1 所示。用于確證的裂解離子比的缺省偏差限值為 ±20%，對于特殊用戶，該值也可由用戶自己設定。另外，最多可有四個不同的子離子被設為定性離子。本文中，使用了缺省值±20% 且僅用一個定性離子。
本文使用梯度液相色譜系統，在 1.8 µm 粒徑的快速分離高通量（RRHT）色譜柱上，在 3.5 分鐘內對所有被分析物和相應的內標物質進行洗脫，所用的流動相僅包含水和乙腈（不含改性劑）。從一次進樣到下一次進樣之間的完整周期約為 8 分鐘。這些化合物使用電噴霧離子源以正離子模式進行分析。與該離子源有關的參數如干燥氣，與液相色譜的流速 0.4ml/min相適應，樣品將由此導入質譜儀。
從離子源向液質聯用儀質量分析器的最大離子轉移電壓由儀器的自動調諧功能進行設置，可以在較寬的質量范圍內獲得優化的信號強度、分離度和質量確證。一個需要根據每個被分析物進行優化的參數是碰撞誘導解圖 2. 本文中分析的阿片類化合物的結構式離電壓，它位于離子源和質量分析器之間的離子轉移光學元件之上。通過優化，能夠使得 QQQ 質量分析器中第一個四極桿上的母離子響應值最大。本次研究中采用 110 V 的碰這些參數設定之后，即可獲得將母離子裂解形成最高響應的子離子的優碰撞能量。至此，關于定量離子的質譜方法學研究工作結束。接著，對次高豐度的子離子的碰撞能量重新進行優化，以上兩種 MRM 是由同一化合物裂解而來的。上述優化步驟可以通過流動注射分析進行。
實驗部分樣品制備添加阿片類化合物的尿樣有以下標示濃度：1，5，10，50，100 和 150 pg/µL，而 6-MRM 的標示濃度要低 15 倍。這些樣品按下述步驟進行處理：1. 起始樣品量為 250 µL2. 加醋酸鈉緩沖液 500 µL3. 加葡萄糖苷酸酶 20 µL4. 加濃度為 500 ng/mL 的內標混合物（去離子水溶液）75 µL5. 渦旋振蕩6. 60 °C 保溫 2 小時7. 加去離子水 850 µL8. 渦旋振蕩并離心9. 取上清液 200 µL 至樣品瓶中所有制備好的樣品均由客戶提供。經過以上處理步驟，樣品濃度稀釋因子為 6.78，因此原尿樣中 1 pg/µL 的濃度，其處理后進樣的實際濃度為 147 fg/µL。通過加入內標物質和提取，各起始濃度的尿樣其對應的進樣濃度如下：0.147，0.737，1.47，7.37，14.7 和 22.12 pg/µL。按進樣量 5µL（參見色譜條件）計算，以上濃度對應的柱上含量為0.737，3.685，7.35，36.85，73.5 和 110.6 pg。對于6-乙酰，各濃度值均為以上數值除以 15。
LC/MS 方法詳細說明LC 條件Agilent 1200 系列二元泵，脫氣機，多孔板進樣器，以及柱溫箱。色譜柱： 安捷倫 ZORBAX SB-C18，2.1 x 50 mm，1.8 µm 粒徑（部件號：822700-902）柱溫： 50 °C流動相： A= 水B= 乙腈流速： 0.4 mL/min進樣量： 5 µL梯度：時間（分鐘） %B0 24 40 Stop time: 6.1 分鐘4.1 90 Post time: 2.0 分鐘6 906.1 2進樣針清洗（25:75 水/甲醇）— 沖洗進樣針口 10 秒質譜條件模式： 使用安捷倫 G1948B 離子源的電噴霧離子化正離子模式霧化器： 60 psig干燥氣流速： 11 L/min干燥氣溫度： 350 °CVcap： 2000 V分離度（FWHM）： Q1=0.7 ； Q2=0.7所有 MRM 的駐留時間 =50 毫秒所有轉變的碰撞誘導解離電壓 =110 V每個化合物的 MRM 及其保留時間見表 1。圓括號中的子離子為定性離子，其保留時間也在圓括
結果與討論所有七個化合物的校正曲線如圖 3A 至 3G 所示，包括三個低濃度的放大圖。所有校正曲線由線性方程擬合而成，不強制過原點，權重設為 1/x。所有曲線的線性相關系數均不低于 0.99，并且在低濃度水平顯示出良好的重現性和精密度。只有一個例外，其低濃度（柱上 49 fg）的三次進樣中僅有兩次有信號。然而，其對應的尿樣濃度0.067 pg/µL（0.067 ng/mL）已遠低于美國藥物濫用與精神衛生服務管理局（SAMHSA）規定的工作場所測試管制值 10 ng/mL。
