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上海斯邁歐分析儀器有限公司
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液相色譜/質譜/質譜方法測定牛尿中的 20-羥基蛻皮酮及代謝物
2023-4-3 閱讀(75)
摘要蛻化類固醇(Ecdysteroids)，是存在于無脊椎動物和植物中的甾體激素，它可能被用于飼料中的蛋白同化制劑。蛻化類固醇的濫用控制依賴于生物基質樣品中微量（µg.L-1）激素有效檢測方法的建立。本文介紹了雙固相萃取柱(C18 和 SiOH)前處理和液相/電噴霧-質譜/質譜技術測定尿樣中 20-羥基-蛻化素及代謝物的分析方法。串聯質譜的高靈敏度和特定性特別適合內標樣品和陽性樣品中的痕量激素成份。所有被檢測的化合物，在 0.12 ng至 12 ng 柱上量范圍內，具有良好的線性。
前言蛻化類固醇(Ecdysteroids)，是存在于無脊椎動物（主要是節肢動物）和植物（菊科植物，石竹科及水龍骨科）中的甾體激素。對于菊科植物，蛻化類固醇的作用是脫毛，而這些分子被認為是保護植物防止非適應性的食素昆蟲的侵襲。原型蛻化類固醇是 20-羥基蛻化素。幾項表明它對動物（鼠、貓和日本鵪鶉）包括禽畜和人具有促生長作用[1-3]。臨床研究表明 20-羥基-蛻化素比美雄酮（methandrostanolone ）具有更強的蛋白同化作用，而且傳統激素的雄化或其它副作用[4]。然而，盡管它們具有生長促進作用，但是只有少數的方法用于生物樣品中 20-羥基-蛻化素的檢測，而且對于其代謝物在禽畜中的有關信息沒有報道[5]。在本應用中，建立了一種可以定性和定量牛尿中痕量水平(ppb)20-羥基-蛻化素及代謝物的分析方法[6]。此方法可以用于牛服用 20-羥基-蛻化素之后，在牛尿樣品中 20-羥基-蛻化素的含量及藥物在體內去除的動力學的研究。
實驗部分Compound Standards22S-23S-高油菜素內酯（屬于油菜素類固醇，一種蔬菜類固醇），購自 Sigma-Aldrich；20-羥基蛻化素、14-去羥基、20-羥基蛻化素、20，26-二羥基蛻化素來自 Lafont 教授的友好支持。樣品前處理25 毫克的 22S，23S-高油菜素內酯作為內標物（IS），加入到牛尿樣品中，在 3500 轉下離心 15 分鐘，然后用 C18 固相萃取柱凈化。固相萃取柱分別用 10 毫升甲醇、10 毫升水活化，然后上樣。分別用 6 毫升水/甲醇（80/20）淋洗固相萃取柱，蛻化類固醇用10 毫升甲醇被洗脫出來。被收集的洗脫液在氮氣流下吹干。用50 微升乙醇和 150 微升環己烷溶解。然后用 SiOH 固相萃取柱進行進一步凈化（之前用 25 毫升環己烷活化）。用 6 毫升乙酸乙酯/環己烷（80/20），目標化合物用 10 毫升氯仿/甲醇/丙酮（6/2/1）洗脫出來。洗脫液用氮氣吹干，再溶于 50 微升甲醇/0.5% 醋酸水溶液（30/70）。10 微升樣品進入液質聯用儀。
儀器液相色譜：色譜柱： GEMINI C18, Phenomenex(3 µm, 110 ?, 50 × 2 mm)/Agilentequivalent: ZORBAX Extend-C18 3.5 µm,2.1 mm × 50 mm (p/n 735700-902)柱溫： 40 °C流動相： A: MeOHB: 0.5% 醋酸水溶液流速： 0.3 mL/min梯度： Time (min) %B0 908 010 012 9016 90進樣量： 10 µL質譜： G 6410A QQQ, Agilent Technologies離子化模式： ESI (+)碰撞電壓： 120 V質量范圍： 100–500 amu駐留時間： 300 ms毛細管電壓： 4000 V霧化器壓力： 35 psi干燥氣流速： 11 L/min干燥氣溫度： 325 °C每個目標化合物的多反應參數見表 1。第一個離子是響應強的離子。
為了評價方法的特定性，空白尿樣添加 1 µg.L-1 的 20-羥基蛻化素。圖 2 顯示了空白樣品的分析結果，在 20E 的位置沒有任何干擾峰，表明分析方法具有優異的選擇性。使用多反應監測模式分析添加20-羥基蛻化素的樣品。結果表明本方法具有優異的靈敏度和很好的信噪比。分析結果滿足歐盟 2002/657 的要求，此歐盟要求要求更多的鑒定點以提高確定度[7]。利用添加五個不同濃度（0.2 ng.mL-1、0.5 ng.mL-1、1 ng.mL-1、5 ng.mL-1 和 20 ng.mL-1)的尿樣進行線性和重現性的評價。校正曲線的線性回歸系數優于(R2)0.99，結果顯示 20-羥基蛻化素具有優異的線性。本方法成功地用于牛在服用 20-羥基蛻化素之后的尿中的激素的濃度水平，一共分析了四天的樣品。在服藥 30 分鐘之后就檢測到尿中含有 20-羥基蛻皮酮，而且濃度水平在 24 小時內持續上升。20-羥基蛻化素有兩個代謝物，分別是 14-去羥基、20 羥基蛻皮酮(M1)和 20，26-二羥基蛻皮酮(M2)[8]。表 1 中是 LC/MS/MS 分析兩個代謝物的參數。圖 3 是 14-去羥基、20 羥基蛻皮酮(M1)在服藥之前和兩天之后的尿樣的分析結果。結果表明，服藥之前沒有檢測出 M1，服藥之后的四天還可以檢測出 M1。根據四個鑒定點的分析原則，在服藥兩天之后，還依然可以檢測 M1。由于在服藥后可以長期檢測出 M1，因此可以監測蛻化類固醇的誤用或濫用。
結論本方法的分析結果表明液相色譜/質譜/質譜技術是能夠有效驗證尿樣中 20-羥基蛻化素及兩個代謝物。這些化合物可以被用于動物是否發生 20-羥基蛻化素的誤用或濫用的監測和控制。串聯四極桿液質聯用儀的多反應監測功能大大提高化合物的定量和確認可信度，滿足歐盟 2002/657/EC 決議的規定。牛尿樣品的成功檢測建立了可靠的分析操作流程。本方法學也可以用于牛尿中20-羥基蛻化素主要代謝物的一級消除動力學研究。
