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上海斯邁歐分析儀器有限公司
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液相色譜-串聯質譜聯用技術用于牛奶中多殘留四環素及其代謝物的檢測
2023-2-27 閱讀(76)
摘要四環素類抗生素最頻繁地被用于畜牧行業中。本文介紹了液相色譜-串聯質譜聯用技術同時檢測牛奶和動物組織中的 10 種抗生素殘留，包括二甲胺四環素、差向四環素、四環素、。安捷倫固相萃取柱和反相 Agilent ZORBAX RX C8 column (5 µm, 150 mm × 2.1 mm)色譜柱在此方法中被用于樣品的純化和分離。各組分的檢測限介于 0.5 至 10.0 µg/kg 之間，定量限(LOQ) 小于 50 µg/kg。 線性校正曲線的范圍是 5 至 1000 µg/kg。總回收率在76.4% 至 101% 之間，相對標準偏差 (RSD, n = 6) 小于 8.4%。本方法快速、靈敏、方便、可靠，可以用于牛奶中多殘留四環素及其代謝物的同時檢測。
前言抗生素在世界范圍內被廣泛地用于控制細菌感染和促進健康家畜的奶產量。四環素類抗生素是一類廣普抗生素，因而被廣泛使用。但是，在奶及奶制品中含有這些抗生素會影響奶的安全性。美國食品藥品管理局(FDA) 限定了四環素，包日允許攝入量(ADI)和牛奶中允許xian量。這些化合物總殘留的日允許攝入量(ADI)是每天每千克體重 25 微克。日允許攝入量(ADI)的60%是用于牛奶，40% 是可食組織。根據日允許攝入量（ADI），牛奶中四環素類，包括四環素的總殘留xian量不能超過 300ppb。四環素的總殘留被設定為 300ppb，三種四環素中每個組分的閾值為 300ppb 也能被接受。在歐盟，根據歐盟 2377/90 號法令建立的牛奶中四環素的最大殘留xian量為 100 µg/kg (100 ppb)。在中國，國標 (GB/T 21317-2007)也設定了牛奶和動物組織中這些化合物的確定方法。該法規于2008 年 4 月 1 日正式生效。本研究的目的是建立利用 Agilent 6410 LC/MS/MS 系統檢測牛奶中四環素及其代謝物的方法。本方法快速而易用。四環素及其代謝物的結構見表 1。
實驗部分化學試劑和化學品液相色譜級的水和甲醇，以及甲酸全部購自 Fluka。標準品都購自Sigma-Aldrich。
樣品前處理提取步驟：1. 稱 5 克牛奶樣品（精確至 0.01 g）加入到 50 毫升比色管中，溶于 0.1 M/L Na2EDTA-Mcllvaine 緩沖液，定容至 50 毫升2. 渦旋震蕩 1 分鐘，提取液在冰水混合液中超聲 10 分鐘3. 將樣品轉移至 50 毫升聚丙烯離心管中并冷卻至 0 °C ~ 4 °C4. 樣品在 15 °C 下， 5000 r/min 離心 10 分鐘5. 快速濾紙過濾凈化：1. 取 10 毫升提取液（相當于 1g 樣品），倒入安捷倫 SampliQOPT 型固相萃取柱（部件號 5982-3036），速度為每秒一滴2. 當它洗脫后，調節 3 mL 水至 pH 4.5 清洗固相萃取柱，然后丟棄所有流出物3. 在 2.0 kPa 的負壓下，抽固相萃取柱 5 分鐘4. 用 10 mL 的 10 mmol 乙二酸的甲醇溶液洗脫5. 收集洗脫液，在 40 °C 下氮氣吹至干6. 用 1 mL 的初始流動相溶解殘留物7. 用 0.45 µm 的濾膜過濾，然后進樣
結果與討論優化和分離碰撞誘導解離電壓和碰撞能量(CE)優化，三重串聯四極桿液質聯用系統是識別、確認和定量食品基質中目標化合物的最佳工具。為了獲得最高的響應，僅僅每個組分的兩個參數被用于質譜優化，即碰撞誘導解離電壓和碰撞能量。合適的碰撞誘導解離電壓是為了將母離子傳輸至質量分析器。合適的碰撞能量提供合格子離子的最高豐度的定量。一種優化方法是在一次運行中設定不同的碰撞誘導解離電壓段來多次進樣。圖 1 是二甲胺四環素采用該方法的圖示。結果表明，對于二甲胺四環素，隨著電壓增加，母離子響應增加很少。采用同樣的方式優化碰撞能量，四環素的結果見圖 2。
最近安捷倫公司推出了方法自動優化（Optimizer）程序，它可以自動進行碰撞誘導解離電壓和碰撞能量的優化，最后將優值存于 Optimizer 數據庫中。 利用這個程序和帶色譜柱或不帶色譜柱的流動進樣模式，用戶只要輸入要優化的化合物名稱和分子式即可。表面質量會根據分子式自動被計算出來。用戶需要正模式或負模式下可能的加合物、小質量去除、任何需要排除的離子以及需要采用的方法（流動相條件等）。一旦開始運行，程序通過用戶選擇的一次進樣增加量開始進樣，確定母離子并利用步進式的電壓梯度進行碰撞誘導解離電壓的優化。然后程序選擇電壓產生最高豐度的母離子。圖 3 是四環素采用該方法的結果。
隨后二次進樣開始進行子離子掃描，然后選擇四個最高豐度的子離子。重復進樣并運行 MRM 采集每個離子的碰撞能量。那些生成信號子離子響應的碰撞能量會自動確定并存入數據庫。對于四環素碰撞能量的結果列于圖 4，圖 5 是離子碎裂曲線。帶子離子的化合物會直接被導入用戶的現有分析方法中。
