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小鼠脾臟CD8+T細胞的磁珠分選
2024-6-20 閱讀(1223)
一、制備脾臟單細胞懸液
8周齡C57BL/6小鼠摘眼球放血，無菌分離脾臟，于70um濾網(wǎng)上研磨收集脾細胞，過濾、離心，再以RPMI-1640wan全培養(yǎng)液重懸。
二、磁珠標記
1. 細胞計數(shù)為8×107/mL。
2. 400×g離心4分鐘，去除上清。
3.每107個細胞總量使用40μL緩沖液重懸。
4.每107個細胞總量添加10μL CD8+T細胞生物su抗體混合物。
5.混勻，4℃孵育 5分鐘。
6.每107個細胞加入2mL緩沖液洗滌細胞，400×g離心4分鐘，去上清。
7.每107個細胞添加80μL 緩沖液。
8.每107個細胞添加20μL抗生物su磁珠。
9.混勻，4℃孵育 10分鐘。
三、磁珠細胞分選
1. 將LS分選柱置于相對應的分選器中。
2. 用適當體積的緩沖液潤洗分選柱.
3. 將細胞懸液轉(zhuǎn)移至分選柱中，收集含有未標記細胞的流出液，即 CD8+T細胞。
4. 加適量的緩沖液，收集總流出物，并與步驟3中的流出液混合，這是CD8+T細胞。
四、流式鑒定
1. 將磁珠分選后得到的CD8+T細胞懸液離心，400 ×g，4min，棄去上清。
2. 細胞沉淀中加入1 mLwan全培養(yǎng)基，計數(shù)。
3. 從中取出兩份細胞（一份大概1×106個細胞），設置為blank和CD8+T染色組。
4. CD8+T染色組加入200 μL流式染色緩沖液，再加入5 μL Anti-Mo CD8a，吹打均勻，常溫避光孵育15min；
5. 孵育結束后，PBS洗滌細胞，離心去上清；
6. 加入200 μL流式染色緩沖液，上機檢測。
