A液：400ul （20uM濃度：每塊分離膠加入40ul；50uM濃度：每塊分離膠加入100ul；）

B液：400ul （20uM濃度：每塊分離膠加入40ul；50uM濃度：每塊分離膠加入100ul；）

注：常規使用濃度為20uM，如過表達體系；如果目的蛋白濃度較低，則建議使用50uM或者100uM濃度。（最佳使用濃度取決于蛋白，請根據每個蛋白的具體情況摸索合適的條件）

1. 按照常規配制分離膠的配方進行配膠（配方參見附表）；

2. 在加入TEMED之前加入產品A液和B液（需要充分混勻）；

4度避光保存，12-18個月

1. 提高轉膜效率

電泳后，電轉之前，需要使用螯合劑（EDTA）從凝膠中除去錳離子（Mn2+）。此步驟可提高磷酸化和非磷酸化蛋白轉移到PVDF膜上的轉移效率。

1）電泳后，將凝膠在含有1?10mmol/L EDTA的轉膜緩沖液中浸泡至少10分鐘，同時輕輕搖動。（10分鐘×1?3次）。

2）接下來，將凝膠在不含EDTA的轉膜緩沖液中浸泡10分鐘，同時輕輕搖動（10分鐘×1次）。

3）強烈推薦使用濕法進行轉膜，也可以使用半干法。

2. 條帶彎曲

P-Tag電泳SDS-PAGE常見的問題是“條帶彎曲”。需要確保樣品中不含有EDTA。

1）預染的marker：由于泳道之間鹽濃度的差異，marker和樣品的條帶均會受影響。使用預染marker常常導致條帶彎曲，在含有該Marker的溶液和其他溶液之間至少需要留一條空白泳道。

2）酸性樣品：條帶可能彎曲。如果溶液為黃色至橙色，即使在加入上樣緩沖液后，請加入Tris緩沖液直到其為中性（紫色）。

3）EDTA（Mn2+被螯合），釩酸，無機鹽，表面活性劑等可引起條帶彎曲或拖尾。4）空白泳道：空白泳道可能會導致條帶彎曲。在空白泳道中加入等量的1x上樣緩沖液。

5）釩酸：競爭結合磷酸可能導致條帶彎曲。使用不同的磷酸酶抑制劑，或通過TCA沉淀或透析

6）將MnCl2添加到樣品中（如終濃度1mM）可能改善結果。如果樣品有EDTA殘留，添加的Mn2+被螯合而不是凝膠中含有的Mn2+。