細胞內羥基自由基的檢測對于理解正確的細胞氧化還原調節及其異常調節對各種病理的影響至關重要。羥基自由基（'OH）是與其他分子高度反應以獲得穩定性的活性氧（ROS）之一。通常，羥基自由基被認為是氧化代謝的有害副產物，可能導致生命系統受到分子破壞。它的平均壽命為10-9納秒，可以與幾乎每個生物分子發生反應，例如核DNA，線粒體DNA，蛋白質和膜脂。AAT Bioquest的Cell Meter™線粒體羥基自由基檢測試劑盒經過優化，可檢測線粒體中的羥基自由基。MitoROS™OH580是活細胞滲透探針，可以快速，選擇性地靶向活細胞中的羥基。與'OH'反應時，它會產生紅色熒光，并且易于閱讀。Cell Meter™線粒體羥基自由基檢測試劑盒提供了一種靈敏的熒光探針，可在孵育一小時后檢測活細胞中的OH'。該試劑盒可用于熒光酶標儀和熒光顯微鏡應用。

1. 準備細胞
2. 將細胞與MitoROS™OH580工作溶液在37°C下孵育60分鐘
3. 孵育細胞與測試化合物（以誘導OH ^- ）
4. 監視Ex / Em = 540/590 nm處的熒光增加

重要說明
使用前，請在室溫下解凍所有組件。

儲備溶液的制備

除非另有說明，否則所有未使用的儲備溶液應分為一次性使用的等分試樣，制備后應儲存在-20°C下。避免重復凍融循環。

1. MitoROS™OH580儲備溶液（500X）：
將50 µL DMSO（組分C）加入小瓶MitoROS™OH580（組分A）中，并充分混合。注意：25 uL的儲備液足以容納1個板。注意：如果管子密封嚴密且避光，則可將未使用的部分等分并在≤-20ºC的溫度下存放超過一個月。避免重復凍融循環。

準備工作溶液

將25μL的500X DMSO重構的MitoROS™OH580儲備溶液添加到10 mL的測定緩沖液（組分B）中。拌勻 注意：該工作溶液在室溫下至少可穩定2小時。

程序

1. 除去培養基，然后將100 µL /孔（96孔板）或25 µL /孔（384孔板）的MitoROS™OH580工作溶液添加到細胞板中。在37°C下孵育細胞60分鐘。
    
2. 要誘導羥基自由基，請在所需的緩沖液（例如PBS或HHBS）中于37°C用測試化合物處理細胞一段所需的時間，并避光。注意：我們在37°C下用Fenton反應（10 µM CuCl ₂和100 µM H ₂ O ₂）處理HeLa細胞1小時，以誘導外源羥基自由基。有關詳細信息，請參見圖1。我們在37°C的生長培養基中用PMA（佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯）處理RAW 264.7細胞4小時，以刺激內源性羥基自由基。
    
3. 用HHBS或DPBS洗滌細胞2-3次，然后向每個孔中添加100 µL分析緩沖液（組分B）。
    
4. 使用帶有TRITC濾光片組的熒光顯微鏡監測細胞中的熒光信號，或使用底部讀模式在Ex / Em = 540/590 nm（截止= 570 nm）下使用熒光酶標儀測量熒光的增加。