FAM-VAD是可透過綠色熒光細(xì)胞的多胱天蛋白酶抑制劑，可靶向1、2、3、6、8、9或10個(gè)胱天蛋白酶。一旦進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，該抑制劑就會(huì)與活性胱天蛋白酶共價(jià)結(jié)合，從而產(chǎn)生綠色熒光。當(dāng)添加到細(xì)胞群中時(shí)，F(xiàn)AM-VAD-FMK探針進(jìn)入每個(gè)細(xì)胞，并與存在于活性胱天蛋白酶異二聚體大亞基上的反應(yīng)性半guangansuan殘基共價(jià)結(jié)合，從而抑制了進(jìn)一步的酶促活性。結(jié)合的標(biāo)記試劑保留在細(xì)胞內(nèi)，而任何未結(jié)合的試劑將擴(kuò)散出細(xì)胞并被洗去。綠色熒光信號(hào)是添加試劑時(shí)細(xì)胞中存在的活性胱天蛋白酶數(shù)量的直接量度。包含結(jié)合了標(biāo)記試劑的細(xì)胞可以通過基于96孔板的熒光法，熒光顯微鏡，或流式細(xì)胞儀。它可在人類，嚙齒動(dòng)物和果蠅等多種細(xì)胞系中起作用。

協(xié)議范例

乍看上去

重要筆記

重要的是要存放在<-15°C的環(huán)境中，并應(yīng)存放在陰涼處。

自收到之日起12個(gè)月內(nèi)可以使用。

程序

以下協(xié)議僅提供指導(dǎo)，應(yīng)根據(jù)您的特定需求進(jìn)行修改。

使用AMC，AFC，pNA，R110和ProRed底物的常規(guī)解決方案胱天蛋白酶測定

1. 在DMSO中準(zhǔn)備10 mM的儲(chǔ)備溶液。
   

2. 如下準(zhǔn)備2X半胱天冬酶底物（50 µM）分析溶液：50 µL底物原液，100 µL DTT（1M），400 µL EDTA（100 mM），10 mL Tris Buffer（20 mM），pH = 7.4。
   

3. 將等體積的半胱天冬酶標(biāo)準(zhǔn)品或樣品與2X半胱天冬酶底物測定溶液混合，并在室溫下孵育至少1小時(shí)。
   

4. 使用熒光酶標(biāo)儀讀取熒光，或使用酶標(biāo)儀讀取吸光度。

使用細(xì)胞滲透性FMK Caspase探針的細(xì)胞Caspase測定

1. 在DMSO中準(zhǔn)備2-5 mM的儲(chǔ)備溶液。
   

2. 根據(jù)需要處理細(xì)胞。
   

3. 通過用20 mM Hepes緩沖液（HHBS）在Hanks中稀釋DMSO儲(chǔ)備溶液（來自步驟2.1），制備2X滲透性半胱天冬酶底物（20 µM）分析溶液。
   

4. 將等體積的處理過的細(xì)胞與2X半胱天冬酶底物測定溶液混合（來自步驟2.3），并在37°C，5％CO _2的  培養(yǎng)箱中孵育細(xì)胞至少1小時(shí)。
   

5. 用HHBS清洗細(xì)胞至少一次。
   

6. 通過流式細(xì)胞儀，熒光顯微鏡或熒光酶標(biāo)儀監(jiān)測熒光強(qiáng)度。

使用細(xì)胞滲透性FMK Caspase探針進(jìn)行細(xì)胞半胱天冬酶測定 （僅適用于＃13470-13476）

1. 通過向小瓶中加入50 µL DMSO制備250X儲(chǔ)備液。
   

2. 根據(jù)需要處理細(xì)胞。
   

3. 以1：250的比例將250 X DMSO儲(chǔ)備溶液添加到細(xì)胞溶液中（例如2 µL至500 µL細(xì)胞），并將細(xì)胞在37°C，5％CO2的培養(yǎng)箱中孵育1小時(shí)。
   

4. 用HHBS清洗細(xì)胞至少一次。
   

5. 通過流式細(xì)胞儀，熒光顯微鏡或熒光酶標(biāo)儀監(jiān)測熒光強(qiáng)度。