腫瘤細(xì)胞對(duì)細(xì)胞毒性藥物的耐藥性被認(rèn)為是成功化療的主要障礙之一。某些腫瘤zui初是有抵抗力的,對(duì)細(xì)胞抑制藥物的治療從未反應(yīng)。其他人zui初反應(yīng)良好,但zui終長(zhǎng)大后變得抵抗。這種現(xiàn)象可能是由于所施用的抗腫瘤劑引起的基因突變所致,或者可能代表了惡性腫瘤中先前存在的耐藥細(xì)胞群的選擇。多種藥物耐藥性(MDR)是導(dǎo)致多種形式化療失敗的主要因素。在過去的幾年中,對(duì)化學(xué)療法的抗性與至少兩個(gè)ATP依賴性藥物外排泵的過表達(dá)相關(guān)聯(lián)已被廣泛接受。這些細(xì)胞膜蛋白稱為P-糖蛋白(Pgp,MDR1),和多藥耐藥相關(guān)蛋白(MRP1)是ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族的成員。我們的測(cè)定試劑盒使用熒光MDR指示劑來測(cè)定這兩種MDR泵的活性。該疏水性熒光染料分子迅速穿透細(xì)胞膜并被困在細(xì)胞中。短暫孵育后,細(xì)胞內(nèi)游離染料濃度會(huì)顯著增加。在表達(dá)MDR1和/或MRP1的細(xì)胞中,這種染料被MDR轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白擠出,從而降低了細(xì)胞的熒光強(qiáng)度。但是,當(dāng)其擠出被干擾MDR1和/或MRP1泵浦活性的物質(zhì)阻止時(shí),其細(xì)胞熒光強(qiáng)度會(huì)顯著增加。我們的MDR分析試劑盒可通過優(yōu)化的分析方法提供所有基本成分。該測(cè)定可以方便的96孔或384孔微量滴定板形式進(jìn)行,并易于適應(yīng)自動(dòng)化。該測(cè)定試劑盒非常適合高通量篩選MDR泵抑制劑或鑒定具有高水平MDR泵活性的細(xì)胞
熒光酶標(biāo)儀 | |
激發(fā) | 490納米 |
發(fā)射 | 525納米 |
隔斷 | 515納米 |
推薦板 | 黑墻/透明底 |
儀器規(guī)格 | 底讀模式 |
組件A:MDR傳感器 | 1小瓶,凍干 |
成分B:DMSO | 1小瓶(100 µL) |
組分C:測(cè)定緩沖液 | 1瓶(10毫升) |
- 準(zhǔn)備細(xì)胞
- 添加MDR抑制劑或化合物
- 添加MDR染料加載溶液(對(duì)于96孔板為100 µL /孔,對(duì)于384孔板為25 µL /孔)
- 在室溫下孵育1小時(shí)
- 使用底部讀取模式監(jiān)控Ex / Em = 490/525 nm時(shí)的熒光強(qiáng)度
重要說明
使用前,請(qǐng)?jiān)谑覝叵陆鈨鏊刑准M件。
儲(chǔ)備溶液的制備
除非另有說明,否則所有未使用的儲(chǔ)備溶液應(yīng)分為一次性使用的等分試樣,并在制備后儲(chǔ)存在-20°C下。避免重復(fù)凍融循環(huán)。
MDR傳感器儲(chǔ)備溶液:
將20 µL(目錄號(hào)36340-1板)或200 µL(目錄號(hào)36341-10板)的DMSO(組分B)加入MDR傳感器(組分A)中,并充分混合。注意:20 µL MDR傳感器原液足以裝滿一塊板。如果未密封的MDR傳感器原液可以分裝,并在< -20 o C下保存1個(gè)月。避光,并避免反復(fù)凍融和潮濕。
準(zhǔn)備工作溶液
MDR染料加載溶液:
將20 µL MDR傳感器儲(chǔ)備溶液添加到10 mL分析緩沖液(組分C)中,并充分混合。注意: MDR染料加載溶液足以裝滿一塊印版,并且在室溫下至少可穩(wěn)定2小時(shí)。
程序
- 通過將10 µL的10X(96孔板)或5 µL的5X(384孔板)化合物加入化合物緩沖液(如PBS或HHBS)中來處理細(xì)胞。對(duì)于空白孔(沒有細(xì)胞的培養(yǎng)基),添加相應(yīng)量的化合物緩沖液。 注意:添加化合物之前不必洗滌細(xì)胞。但是,如果測(cè)試的化合物對(duì)血清敏感,則可以在添加化合物之前將生長(zhǎng)培養(yǎng)基和血清因子吸掉。抽吸后,向孔中添加相同體積的HHBS(例如,對(duì)于96孔板為90 µL,對(duì)于384孔板為20 µL)。或者,細(xì)胞可以在無血清培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。
- 在室溫下孵育或在37細(xì)胞板ø C,5%CO 2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至少15分鐘或期望的時(shí)間段。
- 加入100 µL /孔(96孔板)或25 µL /孔(384孔板)的MDR染料加載溶液。
- 在避光條件下,于室溫下將染料裝載板孵育1小時(shí)。 注意:適當(dāng)?shù)姆跤龝r(shí)間取決于所用的單個(gè)細(xì)胞類型和細(xì)胞濃度。優(yōu)化每個(gè)實(shí)驗(yàn)的孵育時(shí)間。(我們?cè)诜跤龝r(shí)間少于4小時(shí)的情況下獲得了*結(jié)果。) 注意:加載后請(qǐng)勿洗滌細(xì)胞。 注意:對(duì)于非貼壁細(xì)胞,建議孵育后以800 rpm離心細(xì)胞板2分鐘,然后制動(dòng)。
- 使用底部讀取模式監(jiān)控Ex / Em = 490/525 nm的熒光強(qiáng)度。
36340 Screen Quest™熒光法多藥物抗性MDR檢測(cè)試劑盒 *1板* Screen Quest™ Fluorimetric MDR Assay Kit *1 Plate* 100 Tests 36341 Screen Quest™熒光法多藥物抗性MDR檢測(cè)試劑盒 *10板* Screen Quest™ Fluorimetric MDR Assay Kit *10 Plates* 1 kit 36350 Screen Quest™比色法氯離子通道檢測(cè)試劑盒 Screen Quest™ Colorimetric Chloride Channel Assay Kit 10 Plates 36351 Screen Quest™比色法氯離子通道檢測(cè)試劑盒 Screen Quest™ Colorimetric Chloride Channel Assay Kit 100 Plates