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內pH的變化與多種生理和病理過程有關，包括細胞增殖，凋亡，受精，惡性腫瘤，多藥耐藥性，離子轉運，溶酶體貯積病和阿爾茨海默氏病。Cell Meter™熒光細胞內pH值測定試劑盒利用AAT Bioquest專有的熒光指示劑來測量相對細胞內pH值變化。這是一種均質，動力學，活細胞熒光測定法，采用標準程序或酸加載程序。該標準方案設計用于在治療后隨著細胞內pH的降低來測量目標治療靶標。“酸負荷" 該程序旨在測量由于GPCR激活或生長因子活性而引起的細胞代謝與細胞代謝變化相關的pH值升高。通過“酸性加載"程序，將熒光pH染料以zui小體積加載到細胞中后，添加氯化銨溶液。此“加酸"步驟之后，在相對較大體積的緩沖液（?4X）中添加激動劑。突然的體積變化引發細胞中氨（NH3）的流出，導致細胞內pH值迅速降低，從而導致熒光信號降低。激動劑對隨后細胞內pH恢復的作用通過相對熒光信號增加來測量。在將熒光pH染料以zui小體積加載到細胞中后，添加氯化銨溶液。此“加酸"步驟之后，在相對較大體積的緩沖液（?4X）中添加激動劑。突然的體積變化引發細胞中氨（NH3）的流出，導致細胞內pH值迅速降低，從而導致熒光信號降低。激動劑對隨后細胞內pH恢復的作用通過相對熒光信號增加來測量。在將熒光pH染料以zui小體積加載到細胞中后，添加氯化銨溶液。此“加酸"步驟之后，在相對較大體積的緩沖液（?4X）中添加激動劑。突然的體積變化引發細胞中氨（NH3）的流出，導致細胞內pH值迅速降低，從而導致熒光信號降低。激動劑對隨后細胞內pH恢復的作用通過相對熒光信號增加來測量。
平臺
| 熒光酶標儀 | |
| 激發 | 490納米 |
| 發射 | 535納米 |
| 隔斷 | 515納米 |
| 推薦板 | 純黑色 |
| FDSS，FLIPR，ViewLux，NOVOStar，ArrayScan，FlexStation，IN細胞分析儀 |
組件
| 組件A：RatioWorks™BCFL，AM | 1個小瓶 |
| 組件B：10倍Pluronic F127 Plus | 1瓶（10毫升） |
| 成分C：HHBS（具有20 mM Hepes的漢克斯緩沖區） | 1瓶（100毫升） |
| 組分D：50 mM ReadiUse™binghuangshu | 1瓶（10毫升） |
標準細胞負荷的協議摘要（一個板）
在生長培養基中準備細胞
加入等體積的RatioWorks™BCFL，AM染料加工溶液
在37°C孵育1小時
加入50 µL /孔化合物（或505/535 nm和430/535 nm的比率），在Ex / Em = 490/535 nm（截止= 515 nm）下讀取熒光。
載酸方案摘要（一個96孔板）
在生長培養基中準備細胞
除去生長培養基
添加RatioWorks™BCFL，AM染料工作液（50 µL /孔/ 96孔板）
在37°C孵育1小時
添加220 mM NH 4 Cl（5 µL /孔）
在室溫孵育15分鐘
加入200 µL /孔化合物（或505/535 nm和430/535 nm的比率），在Ex / Em = 490/535 nm（截止= 515 nm）下讀取熒光。
重要說明
開始實驗之前，請在室溫下解凍所有試劑盒組件。
除非另有說明，否則所有未使用的儲備溶液應分為一次性使用的等分試樣，并在制備后儲存在-20°C下。避免重復凍融循環。
1. RatioWorks™BCFL，AM儲備溶液：
將200 µL DMSO加入小瓶的Ratioatio™BCFL，AM（組分A）中，并充分混合以制成RatioWorks™BCFL，AM儲備溶液。注意：20 µL的重組過的RatioWorks™BCFL，AM儲備溶液足以用于一盤標準細胞上樣。10 µL的重組過的RatioWorks™BCFL，AM儲備溶液足以容納1盤酸負載。如果將管密封，RatioWorks™BCFL，AM儲備溶液可以在≤-20 o C下保存一個月。避光。
準備工作溶液
對于標準細胞上樣（一塊板）
1.將1 mL的10X Pluronic F127 Plus（組分B）添加到9 mL的HHBS（組分C）中，并充分混合以制成1X分析緩沖液。注意： 對于需要binghuangshu進行加載的細胞（例如CHO細胞），請以1至5 mM的濃度稀釋50 mM ReadiUse™binghuangshu（組分D）（對于CHO細胞，優選5 mM）。
2.將20 µL重構的RatioWorks™BCFL，AM儲備溶液添加到10 mL的1X分析緩沖液中，并充分混合以制成RatioWorks™BCFL，AM染料工作溶液。該RatioWorks™BCFL，AM染料加工溶液在室溫下至少可穩定2小時。
對于酸性負載（一個96孔板）
1.將1 mL的10X Pluronic F127 Plus（組分B）添加到4 mL的HHBS（組分C）中，并充分混合以制成1X分析緩沖液。注意： 對于需要binghuangshu進行加載的細胞（例如CHO細胞），請以0.5至2.5 mM的濃度稀釋50 mM ReadiUse™binghuangshu（成分D）（對于CHO細胞，優選2.5 mM）。
2.將10 µL重構的RatioWorks™BCFL，AM儲備溶液添加到5 mL的1X分析緩沖液中，并充分混合以制成RatioWorks™BCFL，AM染料工作溶液。該RatioWorks™BCFL，AM染料加工溶液在室溫下至少可穩定2小時。
程序
針對標準細胞負載進行pH測定
將100 µL /孔（96孔板）或25 µL /孔（384孔板）的RatioWorks™BCFL，AM染料工作液添加到細胞板中。注意：如果您的化合物干擾血清，則必須用HHBS緩沖液（對于96孔板為100 µL /孔，對于384孔板為25 µL /孔）替換生長培養基，這一點很重要。
將染料加載板在細胞培養箱中孵育30分鐘，然后在室溫下再孵育30分鐘。注意：如果測定需要37°C，請立即進行實驗，而無需進一步室溫孵育。
通過使用HHBS或所需的緩沖液來準備復合板。
通過監控Ex / Em = 490/535 nm（截止= 515 nm）或505/535 nm和430/535 nm（截止= 515 nm）的熒光來進行pH分析，以進行比率測量。化合物添加量為50 µL /孔（96孔板）或25 µL /孔（384孔板）。注意：測定應在添加化合物后3至5分鐘內完成，但是建議在測定開發期間至少收集8分鐘的數據。
運行pH值測定酸負荷
從細胞板中去除生長培養基。
將50 µL /孔/ 96孔板Ratioatio™BCFL，AM染料加工溶液添加到細胞板中。
將染料加載板在細胞培養箱中孵育30分鐘，然后在室溫下再孵育30分鐘。注意：如果測定需要37°C，請立即進行實驗，而無需進一步室溫孵育。
加入5 µL 220 mM NH 4 Cl并將板離心5秒。在室溫下孵育15分鐘。注意： NH 4 Cl溶液應在HHBS（組分C）中新鮮配制。
通過使用HHBS或所需的緩沖液來準備復合板。
通過監控Ex / Em = 490/535 nm（截止= 515 nm）或505/535 nm和430/535 nm（截止= 515 nm）的熒光來進行pH分析，以進行比率測量。化合物添加量為200 µL /孔/ 96孔板。注意：測定應在添加化合物后3至5分鐘內完成，但是建議在測定開發期間至少收集8分鐘的數據。
數據分析
| 21180 | Cell Meter™熒光法細胞內pH檢測試劑盒 | Cell Meter™ Fluorimetric Intracellular pH Assay Kit | 1000 Tests |
| 21189 | RatioWorks™BCFL,酸*BCECF的代替品* | RatioWorks™ BCFL Acid *Superior replacement for BCECF* | 1 mg |
| 21190 | RatioWorks™BCFL,AM*BCECF的代替品* | RatioWorks™ BCFL, AM *Superior replacement for BCECF* | 1 mg |
| 21191 | RatioWorks™BCFL,SE*BCECF的代替品* | RatioWorks™ BCFL, SE | 1 mg |
