對于許多免疫組織化學（IHC）應用，傳統的酶促擴增程序足以實現足夠的抗原檢測。但是，有幾個因素限制了這些過程的敏感性和實用性。乙酰胺信號放大（TSA）已被證明是一種特別通用且功能強大的酶放大技術，具有更高的測定靈敏度。TSA基于HRP在低濃度過氧化氫存在下將標記的含酪胺底物轉化為可與HRP或附近的laoansuan殘基共價結合的氧化的高反應性自由基的能力。為了實現zui大程度的IHC檢測，酪胺預先標記有熒光團。通過每個過氧化物酶標記的多個酪酰胺底物的更新而產生的信號放大轉化為低豐度靶標的超靈敏檢測以及使用更少量的抗體和雜交探針。在免疫組織化學應用中，源自TSA方法的靈敏度增強可以增加一抗稀釋度以減少非特異性背景信號，并且可以克服由于次優固定程序或目標表達水平低而導致的免疫標記弱的問題。iFluor™488酪酰胺包含非常明亮和耐光的iFluor™488，可以使用標準FITC過濾器套件輕松檢測到。從TSA方法獲得的靈敏度增強允許增加一抗稀釋度以減少非特異性背景信號，并且可以克服由于次優固定程序或靶標表達水平低而導致的弱免疫標記。iFluor™488酪酰胺包含非常明亮和耐光的iFluor™488，可以使用標準FITC過濾器套件輕松檢測到。從TSA方法獲得的靈敏度增強允許增加一抗稀釋度以減少非特異性背景信號，并且可以克服由于次優固定程序或靶標表達水平低而引起的免疫標記薄弱的問題。iFluor™488酪酰胺包含非常明亮和耐光的iFluor™488，可以使用標準FITC過濾器套件輕松檢測到。

平臺

1. 修復/透化/阻斷細胞或組織

2. 在封閉緩沖液中添加一抗

3. 加入結合HRP的二抗

4. 準備酪酰胺工作溶液，并在室溫下在細胞或組織中涂抹5-10分鐘

儲備溶液的制備

除非另有說明，否則所有未使用的儲備溶液應分為一次性使用的等分試樣，并在制備后儲存在-20°C下。避免重復凍融循環。

乙酰胺儲備溶液（200X）：
將100 µL DMSO加入小瓶中并充分混合。注意：未使用的乙酰胺儲備溶液可在2-8 ^o C下儲存。

準備工作溶液

酪酰胺工作溶液（1X）：
將100 µL酪酰胺儲備溶液添加到您選擇的20 mL含有0.003％H ₂ O ₂的緩沖液中。 注意：可以使用pH = 7.4的Tris Buffer以獲得*性能。注意：應立即使用Tyramide工作溶液，并在使用當天變新鮮。注意： 20 mL溶液適合200次測試。

程序

該方案適用于細胞和組織染色。

細胞固定和通透性

1. 在室溫下用3.7％甲醛或低聚甲醛的PBS固定細胞或組織20分鐘。
   

2. 用PBS沖洗細胞或組織兩次。
   

3. 在室溫下用0.1％Triton X-100溶液透化細胞1-5分鐘。
   

4. 用PBS沖洗細胞或組織兩次。

組織固定，脫石蠟和補液

過氧化物酶標記

1. 可選：通過在過氧化物酶淬滅溶液（例如3％過氧化氫）中孵育細胞或組織樣品10分鐘來淬滅內源性過氧化物酶活性。在室溫下用PBS沖洗兩次。
   

2. 可選：如果使用結合HRP的鏈霉親和素，建議通過shengwusu封閉緩沖液封閉內源性shengwusu。
   

3. 在4°C下用shou選的封閉溶液（例如含1％BSA的PBS）封閉30分鐘。
   

4. 除去封閉溶液，并添加在推薦抗體稀釋液中稀釋的di一抗體，在室溫下放置60分鐘，或在4°C下放置過夜。
   

5. 用PBS洗滌3次，每次5分鐘。
   

6. 將100 µL二級抗體-HRP工作溶液應用于每個樣品，并在室溫下孵育60分鐘。注意：孵育時間和濃度可以根據信號強度而變化。
   

7. 用PBS洗滌3次，每次5分鐘。

酪酰胺標記

1. 準備并向每個樣品中加入100 µL的Tyramide工作溶液，并在室溫下孵育5-10分鐘。 注意：如果觀察到非特異性信號，則可以縮短與Tyramide的孵育時間。您應該在不同的孵育時間點使用陽性和陰性對照樣品優化孵育時間。或者您可以在工作溶液中使用較低濃度的乙酰胺。
   

2. 用PBS沖洗3次。

復染和熒光成像

1. 根據需要對細胞或組織樣本進行復染。AAT提供了一系列核復染色試劑，如表1所示。請按照試劑隨附的說明進行操作。
   

2. 使用具有防褪色特性的安裝介質安裝蓋玻片。
   

3. 使用適當的過濾器設置以可視化來自Tyramide標記的信號。

表1.建議用于核復染色的產品。

計算器

普通儲備溶液的制備

表1.將iFluor™488酪酰胺的特定質量重構至給定濃度所需的DMSO體積。請注意，該體積僅用于制備儲備溶液。有關適當的實驗/生理緩沖液，請參閱樣本實驗方案。

糖度計算器

輸入任何兩個值（質量，體積，濃度）以計算第三個值。