細(xì)胞內(nèi)羥基自由基的檢測(cè)對(duì)于理解正確的細(xì)胞氧化還原調(diào)節(jié)及其異常調(diào)節(jié)對(duì)各種病理的影響至關(guān)重要。羥基自由基（'OH）是與其他分子高度反應(yīng)以獲得穩(wěn)定性的活性氧（ROS）之一。通常，羥基自由基被認(rèn)為是氧化代謝的有害副產(chǎn)物，可能導(dǎo)致生命系統(tǒng)受到分子破壞。它的平均壽命為10-9納秒，可以與幾乎每個(gè)生物分子發(fā)生反應(yīng)，例如核DNA，線粒體DNA，蛋白質(zhì)和膜脂。AAT Bioquest的Cell Meter™線粒體羥基自由基檢測(cè)試劑盒經(jīng)過(guò)優(yōu)化，可檢測(cè)線粒體中的羥基自由基。MitoROS™OH580是活細(xì)胞滲透探針，可以快速，選擇性地靶向活細(xì)胞中的羥基。與'OH'反應(yīng)時(shí)，它會(huì)產(chǎn)生紅色熒光，并且易于閱讀。Cell Meter™線粒體羥基自由基檢測(cè)試劑盒提供了一種靈敏的熒光探針，可在孵育一小時(shí)后檢測(cè)活細(xì)胞中的OH'。該試劑盒可用于熒光酶標(biāo)儀和熒光顯微鏡應(yīng)用。

1. 準(zhǔn)備細(xì)胞
2. 將細(xì)胞與MitoROS™OH580工作溶液在37°C下孵育60分鐘
3. 孵育細(xì)胞與測(cè)試化合物（以誘導(dǎo)OH ^- ）
4. 監(jiān)視Ex / Em = 540/590 nm處的熒光增加

重要說(shuō)明
使用前，請(qǐng)?jiān)谑覝叵陆鈨鏊薪M件。

除非另有說(shuō)明，否則所有未使用的儲(chǔ)備溶液應(yīng)分為一次性使用的等分試樣，并在制備后儲(chǔ)存在-20°C下。避免重復(fù)凍融循環(huán)。

1. MitoROS™OH580儲(chǔ)備溶液（500X）：
將50 µL DMSO（組分C）加入小瓶MitoROS™OH580（組分A）中，并充分混合。注意：25 uL的儲(chǔ)備液足以容納1個(gè)板。注意：如果管子密封嚴(yán)密且避光，則可將未使用的部分等分并在≤-20ºC的溫度下存放超過(guò)一個(gè)月。避免重復(fù)凍融循環(huán)。

準(zhǔn)備工作溶液

將25μL的500X DMSO重構(gòu)的MitoROS™OH580儲(chǔ)備溶液添加到10 mL的測(cè)定緩沖液（組分B）中。拌勻 注意：該工作溶液在室溫下至少可穩(wěn)定2小時(shí)。

程序

1. 除去培養(yǎng)基，然后將100 µL /孔（96孔板）或25 µL /孔（384孔板）的MitoROS™OH580工作溶液添加到細(xì)胞板中。在37°C下孵育細(xì)胞60分鐘。
    
2. 要誘導(dǎo)羥基自由基，請(qǐng)?jiān)谒璧木彌_液（例如PBS或HHBS）中于37°C用測(cè)試化合物處理細(xì)胞一段所需的時(shí)間，并避光。注意：我們?cè)?7°C下用Fenton反應(yīng)（10 µM CuCl ₂和100 µM H ₂ O ₂）處理HeLa細(xì)胞1小時(shí)，以誘導(dǎo)外源羥基自由基。有關(guān)詳細(xì)信息，請(qǐng)參見(jiàn)圖1。我們?cè)?7°C的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中用PMA（佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯）處理RAW 264.7細(xì)胞4小時(shí)，以刺激內(nèi)源性羥基自由基。
    
3. 用HHBS或DPBS洗滌細(xì)胞2-3次，然后向每個(gè)孔中添加100 µL分析緩沖液（組分B）。
    
4. 使用帶有TRITC濾光片組的熒光顯微鏡監(jiān)控細(xì)胞中的熒光信號(hào)，或使用底部讀模式在Ex / Em = 540/590 nm（截止= 570 nm）下使用熒光酶標(biāo)儀測(cè)量熒光增加。