6-磷酸葡萄糖（G6P）是葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞中的關(guān)鍵中間體。G6P也可以轉(zhuǎn)化為糖原或淀粉，以儲(chǔ)存在肝臟和肌肉中。G6P被6磷酸葡萄糖脫氫酶（G6PD）用來產(chǎn)生NADPH形式的還原當(dāng)量。這在G6PD缺乏導(dǎo)致溶血性貧血的紅細(xì)胞中尤其重要。AAT Bioquest的Amplite™熒光六磷酸葡萄糖測(cè)定試劑盒提供了一種簡(jiǎn)單，靈敏，基于熒光的快速方法，可用于檢測(cè)血清，血漿，尿液以及細(xì)胞培養(yǎng)樣品等生物樣品中的G6P。在偶聯(lián)酶測(cè)定中，G6P濃度與NADPH成比例相關(guān)，NADPH由熒光NADPH傳感器專門監(jiān)測(cè)。熒光信號(hào)可以通過熒光酶標(biāo)儀讀取。

1. 準(zhǔn)備G6P標(biāo)準(zhǔn)品或測(cè)試樣品（50 µL）
2. 加入G6P工作溶液（50 µL）
3. 在室溫下孵育30分鐘-2小時(shí)
4. 監(jiān)控Ex / Em = 540/590 nm（截止= 570 nm）的熒光增加

重要說明
開始實(shí)驗(yàn)之前，請(qǐng)?jiān)谑覝叵陆鈨鎏准慕M件。

儲(chǔ)備溶液的制備

除非另有說明，否則所有未使用的儲(chǔ)備溶液應(yīng)分為一次性使用的等分試樣，并在制備后儲(chǔ)存在-20°C下。避免重復(fù)凍融循環(huán)。

1. NADP儲(chǔ)備溶液（100X）：
將100 µL H ₂ O加入小瓶NADP（組分C）中，制成100X NADP儲(chǔ)備溶液。

2. G6P標(biāo)準(zhǔn)溶液（100 mM）：
將100 µL H ₂ O或1x PBS緩沖液加到G6P標(biāo)準(zhǔn)溶液（組分D）的小瓶中，制成100 mM G6P標(biāo)準(zhǔn)溶液。

配制標(biāo)準(zhǔn)溶液

為了方便起見，請(qǐng)使用我們的系列稀釋計(jì)

將10 µL 100 mM G6P標(biāo)準(zhǔn)溶液加到990 µL 1x PBS緩沖液中，生成1 mM G6P標(biāo)準(zhǔn)溶液。然后，將100 µL 1 mM G6P標(biāo)準(zhǔn)溶液添加到900 µL 1 x PBS緩沖液中，制成100 µM G6P標(biāo)準(zhǔn)溶液（G6P7）。取100 µM G6P標(biāo)準(zhǔn)溶液（G6P7）并進(jìn)行1：3連續(xù)稀釋，以使用1x PBS緩沖液連續(xù)稀釋G6P標(biāo)準(zhǔn)溶液（G6P6- G6P1）。注意：稀釋的G6P標(biāo)準(zhǔn)溶液不穩(wěn)定，應(yīng)在4小時(shí)內(nèi)使用。

準(zhǔn)備工作溶液

1.將5 mL測(cè)定緩沖液（組分B）加入一瓶酶探針（組分A）中，并充分混合。

2.將50 µL 100X NADP儲(chǔ)備溶液添加到組分A + B的瓶子中，并充分混合以制成G6P工作溶液。注意：此G6P工作溶液足以用于一個(gè)96孔板。

程序

表1。黑色96孔微孔板中的G6P標(biāo)準(zhǔn)品和測(cè)試樣品的布局。G6P = G6P標(biāo)準(zhǔn)品（G6P1-G6P7，0.14至100 µM），BL =空白對(duì)照，TS =測(cè)試樣品。

表2.  每個(gè)孔的試劑組成。

1. 根據(jù)表1和表2提供的布局，準(zhǔn)備G6P標(biāo)準(zhǔn)品（G6P），空白對(duì)照（BL）和測(cè)試樣品（TS）。對(duì)于384孔板，每孔使用25 µL試劑代替50 µL。
    
2. 在G6P標(biāo)準(zhǔn)品，空白對(duì)照和測(cè)試樣品的每個(gè)孔中加入50 µL G6P工作溶液，以使G6P測(cè)定總體積為100 µL /孔。對(duì)于384孔板，將25 µL G6P工作溶液添加到每個(gè)孔中，總體積為50 µL /孔。
    
3. 在避光的條件下，將反應(yīng)在室溫下孵育30分鐘至2小時(shí)。
    
4. 使用熒光板讀數(shù)器在激發(fā)= 530-570 nm，發(fā)射= 590-600 nm（*Ex / Em = 540/590 nm，截止= 570nm）下監(jiān)測(cè)熒光的增加。注意：  該板的內(nèi)容，也可以在A的比例轉(zhuǎn)移到白色透明底板和讀通過吸光度酶標(biāo)儀_575nm處 / A _605nm。與熒光讀數(shù)相比，吸收檢測(cè)的靈敏度較低。 

數(shù)據(jù)分析

1e+41000100101- Dose-responseData legendGenerated with Quest Graph™Glucose-6-Phosphate (uM)RFUHover mouse to interact

從空白標(biāo)準(zhǔn)孔獲得的讀數(shù)（RFU）用作陰性對(duì)照。從其他標(biāo)準(zhǔn)的讀數(shù)中減去該值即可得到基線校正值。然后，繪制標(biāo)準(zhǔn)讀數(shù)，以獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線和方程式。該方程式可用于計(jì)算6-磷酸葡萄糖樣品。