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產品及特點

牛細小病毒染料法熒光定量 PCR 試劑盒是一種傳染性腸炎病毒，會引起牛之間的傳染病，以高熱、嘔吐、白細胞嚴重減少和腸炎為特征，感染病毒后，病牛會迅速脫水，消瘦，眼窩深陷，被毛凌亂，皮膚無彈性，耳鼻，四肢發涼，精神高度沉郁，休克， 死亡。從病初癥狀輕微到嚴重一般不超過 2 天，整個病程一般不超過一周，發病迅速， 傳播范圍廣，因此牛細小病毒的快速準確鑒定對該病的預防和檢疫有著重要作用，為此本公司開發了簡單快捷的牛細小病毒染料法熒光定量 PCR 檢測試劑盒，它具有下列特點：

1. 即開即用，用戶只需要提供病毒樣品。
2. 根據牛細小病毒保守序列設計的專一性引物，與相關病毒無交叉反應。
3. 靈敏度可以達到幾百拷貝/反應。
4. 一管式熒光定量 PCR 檢測，避免后續污染。
5. 本試劑盒足夠 50 次 20μL 反應體系的熒光定量 PCR。
6. 本產品只適用于科研，不能用于臨床診斷。

規格及成分

成分

編號

十孔盒包裝

2×qPCR MagicMix

90408

500 μL（棕色管）

熒光PCR 模板稀釋液

180701

1 mL（黃蓋）

牛細小病毒染料法PCR 引物混合物

14-44000yw

100 μL（白蓋）

牛細小病毒染料法PCR 陽性對照

(1×10E8  拷貝/μL)

14-44000pc

50 μL（紅蓋）

天凈沙核酸釋放劑（試用裝）

61202

20 次（1mL，綠蓋）

使用手冊

14-44000sc

1 份

運輸及保存

低溫運輸、-20℃保存，有效期一年。

自備試劑

DNA 模板、10×ROX（根據機型決定，具體見使用方法）。

使用方法

一、稀釋 PCR 陽性對照（以 10E2-10E7 拷貝/μL 這 6 個 10 倍稀釋度為例）

1. 注意：由于標準品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區域進行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產品穩定性和避免擴散傳染性病原， 本產品不提供活體樣品做陽性對照，只提供可以直接使用的 DNA 片段作為陽性對照。

2. 標記 6 個離心管，分別為 7，6，5，4，3，2。

1. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 模板稀釋液（用帶芯槍頭，下同）。
2. 在  7  號管中加入  5  μL  1×10E8  拷貝/μL  的陽性對照，充分震蕩  1  分鐘，得 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。

1. 換槍頭，在 6 號管中加入 5  μL  1×10E7 拷貝/μL  的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。
2. 換槍頭，在 5 號管中加入 5  μL  1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照到 5 號管中，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。
3. 重復上面的操作直到得到 6 個稀釋度的陽性對照。放冰上待用。二、樣品 DNA 的制備
4. 如果有 N 個樣品，必須設置 N+2 個提取，多出的一個是 PC（樣品制備陽性對照）， 一個是 NC（樣品制備陰性對照）。可以用 10μL 上步制備的 PCR 陽性對照的第 4號（濃度為 1×10E4  拷貝/μL，10μL 相當于 1 萬拷貝）或第 5 號（濃度為 1×10E5拷貝/μL，10μL  相當于  10  萬拷貝）再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣，以此作為 PC。另外用水作為 NC。如果每次制備需要 200μL 樣品，則 PC 和 NC 的體積也必須是 200μL。
5. 用自選方法純化樣品的 DNA，本試劑盒跟市場上大多數病毒 DNA  提取試劑盒兼容。也可以選購本公司的一管式病毒 DNAout 或其升級版柱式病毒 DNAout。本試劑盒免費贈送 20 次天凈沙核酸釋放劑，其使用手冊可從本公司網站通過搜索產品名稱天凈沙核酸釋放劑或產品編號 61202 下載。

三、設置 qPCR 反應（20 μL 體系，在樣品制備室進行）

1. 如果做定量分析并且只做 1 次重復，則標記 N+9 個PCR 管，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品，1 個用于 PCR 陰性對照（用水做模板），6 個用于標準曲線。如果做定性分析，并且只做 1 次重復，則標記 N+4 個PCR 管，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品，1 個用于PCR 陰性對照（用水做模板），1 個用于PCR 陽性對照（用第 4 號管的陽性對照稀釋液做模板）。下面只以定量分析為例描述操作步驟。
2. 在標記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復。樣品管和陰性對照設置完畢

后才設置陽性對照，并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好后后加）：

成分

樣品管

N+2 個

PCR 陰性

對照管

PCR 陽性

對照管（2-7 管）

2×qPCR MagicMix

10 μL

10 μL

各 10 μL

牛細小病毒染料法PCR

引物混合液

2 μL

2 μL

各 2 μL

自備 10×ROX (見注)

2 μL

2 μL

各 2 μL

N+2 待測樣品 DNA 模板

6 μL

不加

不加

超純水

不加

6 μL

不加

第 7 步所得 PCR 陽性對照

不加

不加

各 6μL（2 號樣到

稀釋液（2-7 號）

2 號管，3 號樣到 3

號管…）

注:僅 ABI7500、7700 和 7900 儀器需要使用ROX 作為對照，其他熒光 PCR 儀器（如 iCycler IQ、MJ Option、MJ Chromo4、MX3000、MX4000、RotorGene 3000、RotorGene 6000 和 LightCycler480）不需要使用 ROX，則用水替代。

1. 蓋上蓋子后上機，按下面參數進行 PCR（具體 PCR 參數可以根據儀器不同而自行優化）。

四、數據處理

1. 如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct 值為縱軸，繪制標準曲線。再以待測樣品的 Ct 值從標準曲線上推算出樣品 DNA 濃度的log 值，再推算出其濃度。
2. 如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性，則陰性對照 Ct 必須大于或等于 40。陽性對照必須有熒光對數增長，有典型擴增曲線，Ct  值應該小于或等于30。對待測樣品，如果其 Ct 大于或等于 40 則為陰性，如果小于或等于 35 則為陽性。如果在 35-40 之間，則重復一次。重復實驗的 Ct 值如果大于或等于 40 則

為陰性，如果小于 40，則為陽性。

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