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硝酸還原酶(NR)試劑盒

硝酸還原酶(NR)試劑盒

本試劑盒僅供科研使用 1 硝酸還原酶（Nitrate Reductase，NR）活性測定試劑盒說明書 （貨號：WS2040F 分光法 48 樣） 一、產品簡介： 硝酸還原酶（NR，EC 1.7.1.3）廣泛存在于植物中，是一種誘導酶。是植物硝態氮轉 化為氨態氮的關鍵酶，與作物有效吸收和利用氮素肥料有關，是植物營養或農田施肥的 指標之一，也可作為品種選育的指標之一。 本試劑盒采用離體法檢測，通過硝酸還原酶催化硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，亞硝酸鹽進 一步與磺胺及α-萘胺定量生成紫紅色偶氮化合物；顏色深淺與硝酸還原酶活性呈正比， 通過檢測該物質于 530nm 的吸光值，即可得出硝酸還原酶的活性。 二、試劑盒的組成和配制： 試劑名稱 規格 保存要求 備注 提取液 液體 70mL×1 瓶 4℃保存 試劑一 粉劑 mg×1 瓶 4℃保存 用前甩幾下使試劑落入試管底部，再加 18mL 提 取液溶解，仍 4℃保存。 試劑二 粉劑 mg×4 支 -20℃保存 用前甩幾下或離心使粉劑落入底部，每支分別加 1.8mL 蒸餾水溶解，用不完的試劑分裝后-20℃保 存，禁止反復凍融，三天內用完。 試劑三 粉劑 mg×2 瓶 4℃保存 用前甩幾下使試劑落入底部，每瓶分別加 12mL 蒸餾水，于 70℃水浴約半小時至*全溶解備用。 試劑四 液體 22mL×1 瓶 4℃保存 使用前需超聲至*全溶解。 標準品 粉劑 mg×1 支 4℃保存 若重新做標曲，則用到該試劑。 三、所需的儀器和用品： 可見分光光度計、1mL 玻璃比色皿（光徑 1cm）、可調式移液器、水浴鍋/恒溫培養箱、 臺式離心機、研缽、冰和蒸餾水。 四、硝酸還原酶（NR）活性測定： 由于硝酸還原酶是個誘導酶，酶活性大小與取樣前是否誘導有關（施過氮肥、光照充足 條件下所取植物樣本即為誘導處理樣本），因此務必取 2 個樣本做預測定，依據預測定結果選 擇是否進行誘導處理。 酶的誘導（選做）：取適量新鮮樣本洗凈，放入盛有 1mg/mL 硝酸鉀溶液（自備）的 燒杯中（淹沒即可），浸泡 2h，取出樣本用濾紙吸干后，-20℃冷凍 30min，取出樣本再 用濾紙吸干后即可按照樣本制備步驟制備待測上清液。 1、樣本制備： ① 組織樣本：稱取約 0.1g 組織，加入 1mL 提取液，進行冰浴勻漿(難磨樣本可用石英 砂研磨，不能用液氮研磨)。12000rpm，4℃離心 10min，取上清液，置冰上待測。 【注意】提取過程操作應迅速，并且在 4℃下進行。若樣本顏色較深（如植物葉片），可在樣本制備過 程中增加除色素步驟：取約 0.2g 組織（水分充足的樣本可取 1g），加入 1mL 的 80%乙醇冰浴勻漿， 12000rpm，4℃離心 10min，棄掉色素較深的上清液；以上除色素步驟重復 2 次。最后向離心得到的 沉淀中加入 1mL 提取液，混勻或再次冰浴勻漿，12000rpm，4℃離心 10min，取上清置冰上待測。 ② 細菌/細胞樣本： 先收集細菌或細胞到離心管內，離心后棄上清；取 500 萬細菌或細胞加入 1mL 提取 液；超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，300W，超聲 3s，間隔 7s，總時間 3min）；12000rpm， 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。 2、上機檢測：本試劑盒僅供科研使用 2 ① 可見分光光度計預熱 30min 以上，調節波長至 530nm，蒸餾水調零。 ② 反應 mix 的制備：已*全溶解的試劑三和試劑四按照 1:1 的比例混合（每次可根據 檢測樣本數量現用現配），試劑三和四*全溶解后于 4℃存放一段時間會有沉淀析 出，每次配置反應 mix 前需重新*全溶解。 ③ 在 EP 管中依次加入： 試劑名稱（μL） 測定管 對照管 樣本 80 80 試劑一 280 試劑二 120 蒸餾水 400 30℃（如水浴鍋或恒溫培養箱）避光培養 30min 反應 mix 400 400 混勻，30℃避光反應 15min，全部澄清液體轉移至 1mL 玻璃比 色皿中，立即于 530nm 處讀取吸光值 A，△A=A 測定-A 對照（每 個樣本需做一個自身對照）。 【注】：1.若△A 值低于 0.005，可增加樣本加樣體積 V1（如增至 150μL，則試劑一相應減少）， 則改變后的 V1 需代入公式重新計算。 2. 若整個反應結束后有沉淀渾濁現象，加完反應 mix 于 30℃避光反應 15min 后，室溫 12000rpm 離心 3min，取全部上清液至 1mL 玻璃比色皿中讀值。 五、結果計算： 1、標準曲線方程：y = 0.8566x - 0.0005；x 為標準品摩爾質量（μmol/mL），y 為△A。 2、按樣本鮮重計算： 單位定義：每小時每克鮮重樣品中催化產生 1nmol NO2ˉ的量為一個 NR 活力單位。 NR(nmol/h/g 鮮重)=[(△A+0.0005)÷0.8566×103×V1]÷(W×V1÷V)÷T=2335×(△A+0.0005)÷W 3、按樣本蛋白濃度計算： 單位定義：每小時每毫克組織蛋白催化產生 1nmol NO2ˉ的量為一個 NR 活力單位。 NR(nmol/h/mg prot)=[(△A+0.0005)÷0.8566×103×V1]÷(V1×Cpr)÷T=2335×(△A+0.0005)÷Cpr 4、按細菌或細胞密度計算： 單位定義：每小時每百萬細菌或細胞催化產生 1nmol NO2ˉ的量為一個 NR 活力單位。 NR(nmol/h/104 cell)=[(△A+0.0005)÷0.8566×103×V1]÷(500×V1÷V)÷T=4.67×(△A+0.0005) V---加入提取液體積，1mL； V1---加入樣本體積：0.08mL； T---反應時間，30min=0.5h； W---樣本鮮重，g； 500---細胞數量，百萬； 標準品亞*酸鈉的分子量---69； Cpr---樣本蛋白質濃度，mg/mL；建議使用本公司的 BCA 蛋白含量檢測試劑盒。 附：標準曲線制作過程： 1 制備標準品母液：標準品用 1mL 的蒸餾水溶解，再用蒸餾水稀釋 200 倍即為 0.5μmol/mL，現配現 用。（母液需在兩天內用且-20℃保存）。 2 把母液稀釋成六個濃度的標準品：0, 0.1,0.2,0.3,0.4, 0.5μmol/mL。也可根據實際來調整標準品濃度。 3 按照測定管的加樣步驟操作，根據結果即可制作標準曲線。