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濾紙酶(FPA)試劑盒,微板法

濾紙酶(FPA)試劑盒,微板法

本試劑盒僅供科研使用 1 濾紙酶（Filter paper Activity，FPA）試劑盒說(shuō)明書(shū) （貨號(hào)：WS5550W 微板法 48 樣） 一、產(chǎn)品簡(jiǎn)介： 纖維素酶是由微生物產(chǎn)生的多組分的酶系，能水解纖維素β-1,4 葡萄糖苷鍵生成葡萄糖， 研究濾紙酶活力對(duì)纖維素酶的研究具有非常重要的意義。 濾紙酶水解濾紙產(chǎn)生的還原糖能與 3,5-二硝基水楊酸生成紅棕色氨基化合物，在 540nm 處有光吸收，在一定范圍內(nèi)反應(yīng)液顏色深淺與還原糖的量成正比，可測(cè)定計(jì)算得濾紙 酶的活力。 二、試劑盒組分與配制： 試劑名稱(chēng) 規(guī)格 保存要求 備注 濾紙條×100 根 4℃保存 試劑一 液體 80mL×1 瓶 4℃保存 試劑二 液體 50mL×1 瓶 4℃保存 標(biāo)準(zhǔn)品 粉體 mg×1 支 4℃保存 若重新做標(biāo)曲，則用到該試劑。 三、所需的儀器和用品： 酶標(biāo)儀、96 孔板、天平、研缽、低溫離心機(jī)、恒溫水浴鍋、可調(diào)式移液器。 四、濾紙酶（FPA）活性測(cè)定： 建議正式實(shí)驗(yàn)前選取 2 個(gè)樣本做預(yù)測(cè)定，了解本批樣品情況，熟悉實(shí)驗(yàn)流程，避免實(shí)驗(yàn) 樣本和試劑浪費(fèi)！ 1、樣本制備： ① 組織樣本： 取約 0.1g 組織（水分充足的樣本可取 0.5g），加入 1mL 蒸餾水，進(jìn)行冰浴勻漿。 4℃×12000rpm 離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。 【注】：若增加樣本量，可按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例進(jìn)行提取 ② 細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞 先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；取約 500 萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 蒸餾 水，超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（功率 300w，超聲 3 秒，間隔 7 秒，總時(shí)間 3min）；4℃×12000rpm 離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。 【注】：若增加樣本量，可按照數(shù)量（104）：提取液體積(mL)為 500-1000：1 的比例進(jìn)行提取 ③ 液體樣本：若是澄清液體，直接檢測(cè)，若液體樣本渾濁，需 4℃×12000rpm，離心 10min， 取上清液檢測(cè)。 2、上機(jī)檢測(cè)： 1 酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 540nm。 2 所有試劑至常溫（25℃）狀態(tài)。 3 每個(gè)樣本需一個(gè)自身對(duì)照即煮沸樣本：樣本于 95-100℃水浴鍋中煮沸 10min 即可。 4 在 EP 管中依次加入： 試劑名稱(chēng)（μL） 測(cè)定管 對(duì)照管 樣本 100 100（煮沸樣本） 濾紙條 1 根 1 根 試劑一 800 800 50℃孵育 60min 試劑二 400 400 混勻，沸水浴（95-100℃）5min，冷卻至室溫本試劑盒僅供科研使用 2 蒸餾水 400 400 混勻，取出 200μL 待檢液至 96 孔板中，于 540nm 處讀 取吸光值 A，ΔA=A 測(cè)定-A 對(duì)照（每個(gè)樣本做一個(gè)樣 本自身對(duì)照）。 【注】1.若 A 測(cè)定值超過(guò) 1.5，可適當(dāng)對(duì)樣本進(jìn)行稀釋再檢測(cè)，或者取 200μL 至 96 孔板前 行稀釋?zhuān)ㄈ缥?100μL 待檢液+100μL 蒸餾水，相當(dāng)于稀釋 2 倍）,則相應(yīng)的稀釋倍數(shù) D 需代入計(jì)算公式計(jì)算。 2. 若ΔA 差值接近零，可增加樣本體積 V1（如增至 200μL，則蒸餾水相應(yīng)減少，保持總體 積不變）或延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間 T（如增至 2h）或增加取樣質(zhì)量 W，則改變后的 V1 和 T 和 W 需代入計(jì)算公式重新計(jì)算。 五、結(jié)果計(jì)算： 1、標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y = 3.6433x + 0.0016，x 是標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量（mg），y 是ΔA。 2、按照蛋白濃度計(jì)算 定義：50℃下，每毫克蛋白每小時(shí)分解濾紙產(chǎn)生 1mg 葡萄糖所需酶量為一個(gè)酶活單位。 FPA(mg/h/mg prot)=[(ΔA-0.0016)÷3.6433]÷(V1×Cpr)÷T×D=2.74×(ΔA-0.0016)÷Cpr×D 3、按照樣本質(zhì)量計(jì)算 定義：50℃下，每克組織每小時(shí)分解濾紙產(chǎn)生 1mg 葡萄糖所需的酶量為一個(gè)酶活單位。 FPA(mg/h/g)=[(ΔA-0.0016)÷3.6433]÷(W×V1÷V)÷T×D=2.74×(ΔA-0.0016)÷W×D 4、按液體體積計(jì)算 定義：50℃下，每毫升液體每小時(shí)分解濾紙產(chǎn)生 1mg 葡萄糖所需酶量為一個(gè)酶活單位。 FPA(mg/h/mL)=[(ΔA-0.0016)÷3.6433]÷V1÷T×D=2.74×(ΔA-0.0016)×D 5、按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算 定義：50℃下，每 104個(gè)細(xì)胞每小時(shí)分解濾紙產(chǎn)生 1mg 葡萄糖所需酶量為一酶活力單位。 FPA(mg/h/104cell)=[(ΔA-0.0016)÷3.6433]÷(V1×細(xì)胞數(shù)量÷V)÷T×D =2.74×(ΔA-0.0016)÷細(xì)胞數(shù)量×D V---提取液體積，1mL； V1---反應(yīng)體系中加入樣本體積，0.1mL； W---樣本質(zhì)量，g； T---反應(yīng)時(shí)間，60min=1 小時(shí)； D---稀釋倍數(shù)，未稀釋即為 1; Cpr---樣本蛋白濃度，mg/mL；建議使用本公司的 BCA 蛋白含量檢測(cè)試劑盒。 附：標(biāo)準(zhǔn)曲線制作過(guò)程： 1 制備標(biāo)準(zhǔn)品母液（5mg/mL）：向標(biāo)準(zhǔn)品 EP 管里面加入 1mL 蒸餾水（母液需在兩天 內(nèi)用且-20℃保存）。 2 把母液稀釋成六個(gè)濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品：0, 0.6, 1.2, 1.8, 2.4, 3. mg/mL。也可根據(jù)實(shí)際 樣本來(lái)調(diào)整標(biāo)準(zhǔn)品濃度。 3 100μL 標(biāo)準(zhǔn)品+800μL 試劑一+400μL 試劑二，混勻，沸水浴（95-100℃）5min，冷 卻至室溫，再加 400μL 蒸餾水，混勻后取出 200μL 待檢液至 96 孔板中，于 540nm 處讀取吸光值 A。根據(jù)結(jié)果即可制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。