隱孢子蟲（CP）ELISA檢測(cè)試劑盒
隱孢子蟲（CP）ELISA檢測(cè)試劑盒
使用說(shuō)明書
檢測(cè)原理
試劑盒采用雙抗體夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）。往預(yù)先包被人隱孢子蟲（CP）捕獲抗體的包被微孔中，依次加入陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照、樣本、HRP標(biāo)記的檢測(cè)抗體，經(jīng)過溫育并*洗滌。用底物TMB顯色，TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成終的黃色。顏色的深淺和樣品中的人隱孢子蟲（CP）呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（OD 值），判斷樣品是否含有人隱孢子蟲（CP）。
樣品收集、處理及保存方法
1. 血清：使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管，操作過程中避免任何細(xì)胞刺激，收集血液后，3000轉(zhuǎn)離心10分鐘將血清和紅細(xì)胞迅速小心地分離。
2. 血漿：EDTA、檸檬酸鹽或肝素抗凝。3000轉(zhuǎn)離心30分鐘取上清。
3. 細(xì)胞上清液：3000轉(zhuǎn)離心10分鐘去除顆粒和聚合物。
4. 組織勻漿：將組織加入適量生理鹽水搗碎。3000轉(zhuǎn)離心10分鐘取上清。
5. 保存：如果樣本收集后不及時(shí)檢測(cè)，請(qǐng)按一次用量分裝，凍存于-20℃，避免反復(fù)凍融，在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。
自備物品
- 酶標(biāo)儀（450nm）
- 高精度加樣器及槍頭：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL
- 37℃恒溫箱
操作注意事項(xiàng)
- 試劑盒保存在2-8℃，使用前室溫平衡20分鐘。從冰箱取出的濃縮洗滌液會(huì)有結(jié)晶，這屬于正?，F(xiàn)象，水浴加熱使結(jié)晶*溶解后再使用。
- 實(shí)驗(yàn)中不用的板條應(yīng)立即放回自封袋中，密封（低溫干燥）保存。
- 預(yù)處理后的樣本無(wú)需稀釋，直接取10μL加樣即可。
- 嚴(yán)格按照說(shuō)明書中標(biāo)明的時(shí)間、加液量及順序進(jìn)行溫育操作。
- 所有液體組分使用前充分搖勻。
試劑盒組成
名稱 | 96孔配置 | 48孔配置 | 備注 |
微孔酶標(biāo)板 | 96孔 | 48孔 | 無(wú) |
陰性對(duì)照 | 0.3mL | 0.3mL | 無(wú) |
陽(yáng)性對(duì)照 | 0.3mL | 0.3mL | 無(wú) |
* | 6mL | 3mL | 無(wú) |
檢測(cè)抗體-HRP | 10mL | 5mL | 無(wú) |
20×洗滌緩沖液 | 25mL | 15mL | 按說(shuō)明書進(jìn)行稀釋 |
底物A | 6mL | 3mL | 無(wú) |
底物B | 6mL | 3mL | 無(wú) |
終止液 | 6mL | 3mL | 無(wú) |
封板膜 | 2張 | 2張 | 無(wú) |
說(shuō)明書 | 1份 | 1份 | 無(wú) |
自封袋 | 1個(gè) | 1個(gè) | 無(wú) |
試劑的準(zhǔn)備
20×洗滌緩沖液的稀釋：蒸餾水按1：20稀釋，即1份的20×洗滌緩沖液加19份的蒸餾水。
洗板方法
- 手工洗板：甩盡孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液，靜置1min后甩盡孔內(nèi)液體，在吸水紙上拍干，如此洗板5次。
- 自動(dòng)洗板機(jī)：每孔注入洗液350μL，浸泡1min，洗板5次。
操作步驟
- 從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回4℃。
- 設(shè)置陰、陽(yáng)性對(duì)照孔和樣本孔，陰、陽(yáng)性對(duì)照孔中加入陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照各50μL；
- 待測(cè)樣本孔先加待測(cè)樣本10μL，再加*40μL；
- 隨后陰、陽(yáng)性對(duì)照孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的檢測(cè)抗體100μL，用封板膜封住反應(yīng)孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。
- 棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液，靜置1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板5次（也可用洗板機(jī)洗板）。
- 每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。
- 每孔加入終止液50μL，15min內(nèi)，在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的OD值。
結(jié)果判斷
1. 試驗(yàn)有效性：陽(yáng)性對(duì)照孔OD值平均值≥1.00；
陰性對(duì)照孔OD值平均值≤0.15。
2. 臨界值（Cut off）計(jì)算：臨界值=陰性對(duì)照孔平均值+0.15
3. 陰性判斷：樣品OD值＜臨界值（Cut off），樣品為陰性
4. 陽(yáng)性判斷：樣品OD值＞臨界值（Cut off），樣品為陽(yáng)性
試劑盒性能
- 準(zhǔn)確性：陽(yáng)性對(duì)照孔OD值平均值≥1.00；陰性對(duì)照孔OD值平均值≤0.15，說(shuō)明試驗(yàn)結(jié)果有效。
- 特異性：不與其它可溶性結(jié)構(gòu)類似物交叉反應(yīng)。
- 重復(fù)性：板內(nèi)、板間變異系數(shù)均小于15%。
- 貯藏：2-8℃，避光防潮保存。
- 有效期：6個(gè)月
免責(zé)聲明
1. 試劑盒僅供研究使用，不得用于臨床實(shí)驗(yàn)或人體實(shí)驗(yàn)，否則所產(chǎn)生的一切后果，由實(shí)驗(yàn)者承擔(dān)，本公司概不負(fù)責(zé)。
2. 嚴(yán)格按照說(shuō)明書操作，實(shí)驗(yàn)者違反說(shuō)明書操作，后果由實(shí)驗(yàn)者承擔(dān)。
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