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上海博湖生物科技有限公司
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PCR反應注意事項
2021-10-8 閱讀(2214)
PCR反應注意事項：
1. 由于PCR反應靈敏度很高，因此要特別主意防止DNA污染的發(fā)生。樣品間的相互污染可能產生假陽性結果，特別是將PCR技術應用到臨床病原菌感染確定中。
2. 如果是公用的、沒有密碼保護的PCR儀，經常檢查PCR儀上的程序正確與否。
3. 不使用過量試劑“l(fā)ess is usually better （more specific）"。
4. 試劑購回后應分裝成小份使用，這樣一旦有污染發(fā)生，可以立即丟棄污染的試劑，不會造成大的損失；試劑分裝也有助于減少反復凍融次數(shù)（例如dNTPs對反復凍融敏感）。
5. 加完所有試劑后用槍頭吹打幾次或稍微渦旋或輕彈管壁以保證充分混勻。
6. 使用陰性對照檢查污染的發(fā)生。
7. 使用陽性對照（能良好擴增的樣本）。
8. 電泳時使用DNA分子量標準品（指示是否PCR失敗或條帶跑出凝膠或拍照系統(tǒng)失敗）。
9. 當擴增很長的、GC含量高的模板時或容易產生二級結構的模板時適量使用添加劑（glycerol, formamide, NMP使變性和退火溫度降低幾度；glycerol也可起到穩(wěn)定聚合酶活性的作用；DMSO 減少二級結構的發(fā)生，并通過減弱非特異性引物結合的穩(wěn)定性，提高反應的特異性）。
10. 不使用帶有自動除霜功能的冰箱存儲酶（避免反復凍融），每次取酶時都使用新的槍頭酶，酶使用后應立即放回冰箱。酶要在加完緩沖液后再加，直接將酶加入水中可能導致酶變性失活。
11. PCR產物的電泳檢測時間，一般為48 h以內，有些最好于當日電泳檢測，大于48h后帶型不規(guī)則甚致消失。
