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分享細菌轉化操作步驟

2021-5-17  閱讀(10667)

細菌轉化操作步驟:

1、事先將恒溫水浴的溫度調到42℃。

2、從-70℃ 超低溫冰柜中取出一管(100μl)感受態菌,立即用手指加溫融化后插入冰上,冰浴5~10min。

3、 加入5μl連接好的質粒混合液(DNA含量不超過100ng),輕輕震蕩后放置冰上20min。

4、 輕輕搖勻后插入42℃水浴中1~2min進行熱休克,然后迅速放回冰中,靜置3~5min。

5、 在超凈工作臺中向上述各管中分別加入500μl LB培養基(不含抗菌素)輕輕混勻,然后固定到搖床的彈簧架上37℃震蕩1h.

6、 在超凈工作臺中取上述轉化混合液100~300μl,分別滴到含合適抗菌素的固體LB平板培養皿中,用酒精燈燒過的玻璃涂布棒涂布均勻(注意:玻璃涂布棒上的酒精熄滅后稍等片刻,待其冷卻后再涂)。

7、 如果載體和宿主菌適合藍白斑篩選的話,滴完菌液后再在平板上滴加40μl 2% X-gal,8μl 20% IPTG,用酒精燈燒過的玻璃涂布棒涂布均勻。

8、 在涂好的培養皿上做上標記,先放置在37℃恒溫培養箱中30-60min直到表面的液體都滲透到培養基里后,再倒置過來放入37℃恒溫培養箱過夜。

9、 在被細菌污染的桌面上噴灑70%乙醇,擦干桌面,寫實驗報告。

10、觀察平板上長出的菌落克隆,以菌落之間能互相分開為好。注意白色菌斑。

 



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