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上海博湖生物科技有限公司
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逆轉錄（RT-PCR）實驗要素介紹
2024-8-5 閱讀(406)
逆轉錄（reverse transcription）實驗作為是常見的分子生物學實驗之一，逆轉錄是以 RNA 為模板合成 DNA 的過程，即 RNA 指導下的 DNA 合成，逆轉錄實驗包括3大要素，分別是引物、逆轉錄酶和 RNA 模板：
1. 引物：逆轉錄引物主要有3種，包括 Oligo(dT)、Random Primers 和基因特異性引物(GSP)。其中 Oligo(dT)具有12-20個 T 堿基，并且與真核生物 mRNA 的 3’Poly A 尾配對，可合成全長的 cDNA，但僅擴增有 polyA 尾的 mRNA ，對模板質量要求高，較適合克隆實驗。而 Random Primers 具有6-9個堿基，可隨機識別模板并結合，適合復雜結構和微量模板，但特異性低，小片段多，適合后續 qPCR 實驗。基因特異性引物可以識別特定模板序列，具有特異性強，靈敏度高的特點，但需合成特定的序列。所以根據不同實驗需求可進行相應引物的選擇。
2. 逆轉錄酶：一種是來自純化的禽成髓細胞瘤病毒(AMV)，由兩條肽鏈組成，具有聚合酶活性和很強的 RNaseH 活性，它最適溫度是42℃，最適 pH8.3，在高反應溫度時可消除 mRNA 的二級結構對逆轉錄的阻礙，然而高水平的 RNaseH 的活性既抑制 cDNA 產生也限制其長度。另一種來源于鼠白血病病毒(M-MLV)，是單肽鏈的，有 RNA 聚合酶活性和相對較弱的 RNaseH 活性，最適溫度37℃，最適 pH7.6，較弱的 RNaseH 活性對獲得2-3kb的 mRNA 的全長 cDNA 有很大好處。
3. RNA 模板：通常利用紫外分光光度計檢測純度，要求A260/280=1.9~2.1，A260/230=2.0~2.2。利用瓊脂糖凝膠電泳檢測 RNA 的完整度，完整的總 RNA 在進行瓊脂糖凝膠電泳時會產生清晰的28S 和18S rRNA 條帶(真核樣品)，28S rRNA 條帶的強度應當大致為18S rRNA 條帶的兩倍，并且無 gDNA 和蛋白殘留。
