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上海博湖生物科技有限公司
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PCR實驗預(yù)準(zhǔn)備事項
2023-12-11 閱讀(349)
實時熒光定量PCR技術(shù)，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進行定量分析的方法。PCR實驗是分子生物學(xué)中常見用的實驗之一，在基因擴增、核酸檢測、基因檢測等方面廣泛應(yīng)用。PCR實驗前的準(zhǔn)備:
在開始PCR實驗之前，必須準(zhǔn)備好DNA模板（基因組DNA或逆轉(zhuǎn)錄制備的cDNA）、特異性引物（自己設(shè)計或用軟件設(shè)計），并選擇合適的商業(yè)酶（選擇符合您實驗?zāi)康牡拿?span style="font-size: 14px; box-sizing: border-box;">)
1、DNA聚合酶。有許多商業(yè) DNA 聚合酶，它們具有不同的特性。一般分為兩類：高保真聚合酶和普通Taq聚合酶。如果您想對沒有任何突變的特定 DNA 片段進行 PCR，請選擇高保真聚合酶。如果只是想檢測特定序列的存在，就選擇普通的Taq聚合酶。如果要對T-vector連接的片段進行PCR，要注意，因為大多數(shù)高保真聚合酶的產(chǎn)物都沒有A-tailing，所以應(yīng)該選擇普通的Taq聚合酶或在PCR實驗后添加A-tailing。
2、引物的特異性影響 PCR 成功的概率，良好的引物設(shè)計對 PCR 擴增的成功至關(guān)重要。當(dāng)您開始設(shè)計引物時，應(yīng)仔細(xì)考慮以下幾個原則：
①引物的長度。PCR引物一般在18-22bp左右。這對于引物特異性和在退火溫度下的結(jié)合來說是足夠長的。
②熔化溫度(Tm)。Tm 定義為在此溫度下，DNA 雙鏈體的一半將解離成單鏈 DNA。52-58C 范圍內(nèi)的引物 Tm 是最佳的。
③GC 含量。最佳 GC 含量應(yīng)為 40-60%。
④許多軟件可用于引物設(shè)計，例如primer5和Oligo。這些軟件推薦的引物通常可以滿足我們的需求。
