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上海邦景實業有限公司
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傳代細胞培養實驗方法
2021-9-7 閱讀(207)
1 、原理
體外培養的原代細胞或細胞株要在體外持續地培養就必須傳代，以便獲得穩定的細胞株或得到大量的同種細胞，并維持細胞種的延續。培養的細胞形成單層匯合以后，由于密度過大生存空間不足而引起營養枯竭，將培養的細胞分散，從容器中取出，以1:2或l:3以上的比率轉移到另外的容器中進行培養，即為傳代培養。
細胞“一代"指從細胞接種到分離再培養的一段期間，與細胞世代或倍增不同。在一代中，細胞培增3～6次。細胞傳代后，一般經過三個階段：游離期、指數增生期和停止期。
常用細胞分裂指數表示細胞增殖的旺盛程度，即細胞群的分裂相數／100個細胞。一般細胞分裂指數介于0.2％～0.5％，腫瘤細胞可達3～5％。細胞接種2～3天分裂增殖旺盛，是活力最好時期，稱指數增生期(對數生)，適宜進行各種試驗。
2 、操作
①．將長成單層的原代培養細胞或HeLa細胞從二氧化碳培養箱中取出，在超凈工作臺中倒掉瓶內的培養液，加入少許消化液。(以液面蓋住細胞為宜)，靜置5～10分鐘。
②.在倒置鏡下觀察被消化的細胞，如果細胞變園，相互之間不再連接成片，這時應立即
在超凈臺中將消化液倒掉，加入3～5ml新鮮培養液，吹打，制成細胞懸液。
③．將細胞懸液吸出2ml左右，加到另一個培養瓶中并向每個瓶中分別加3ml左右培養液，蓋好瓶塞，送回二氧化碳培養箱中，繼續進行培養。
3 、結果
一般情況，傳代后的細胞在2小時左右就能附著在培養瓶壁上，2～4天就可在瓶內形成單層，需要再次進行傳代。
器材及液體的準備和無菌操作的注意事項 ：
1）、 器材和液體的準備
細胞培養用的玻璃器材，如：培養瓶、吸管等在清洗干凈以后，裝在鋁盒和鐵筒中，120℃，2小時干烤滅菌后備用；手術器材、瓶塞、配制好的PBS液用滅菌鍋15磅，20分鐘蒸氣滅菌；MEM培養液、小牛血清、消化液用G6濾器負壓抽濾后備用。
2）、 無菌操作中的注意事項
在無菌操作中，一定要保持工作區的無菌清潔。為此，在操作前要認真地洗手并用75％乙醇消毒。操作前20～30分鐘起動超凈臺吹風。操作時，嚴禁說話，嚴禁用手直接拿無菌的物品，如瓶塞等，而要用器械，如止血鉗、鑷子等去拿。培養瓶要在超凈臺內才能打開瓶塞，打開之前用乙醇將瓶口消毒，打開后和加塞前瓶口都要在酒精燈上燒一下，打開瓶口后的操作全部都要在超凈臺內完成。操作完畢后，加上瓶塞，才能拿到超凈臺外。使用的吸管在從消毒的鐵筒中取出后要手拿末端，將頂端在火上燒一下，戴上膠皮乳頭，然后再去吸取液體。總之，在整個無菌操作過程中都應該在酒精燈的周圍進行。
