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轉化細胞操作步驟與實驗材料
2020-12-16 閱讀(734)
轉化細胞操作步驟:
1. 事先將恒溫水浴的溫度調到42℃。
2. 從-70℃ 超低溫冰柜中取出一管(100 μl)感受態菌,立即用手指加溫融化后插入冰上,冰浴5~10 min。
3. 加入5 μl 連接好的質粒混合液(DNA含量不超過100 ng),輕輕震蕩后放置冰上20 min。
4. 輕輕搖勻后插入42℃水浴中1~2 min進行熱休克,然后迅速放回冰中,靜置3~5 min。
5. 在超凈工作臺中向上述各管中分別加入500 μl LB培養基(不含抗菌素)輕輕混勻,然后固定到搖床的彈簧架上37℃震蕩1 h。
6. 在超凈工作臺中取上述轉化混合液100-300 μl,分別滴到含合適抗菌素的固體LB平板培養皿中,用酒精燈燒過的玻璃涂布棒涂布均勻。
7. 如果載體和宿主菌適合藍白斑篩選的話,滴完菌液后再在平板上滴加40 μl 2% X-gal,8 μl 20% IPTG,用酒精燈燒過的玻璃涂布棒涂布均勻。
8. 在涂好的培養皿上做上標記,先放置在37℃恒溫培養箱中30~60 min 直到表面的液體都滲透到培養基里后,再倒置過來放入37℃恒溫培養箱過夜。
9. 在被細菌污染的桌面上噴灑70%乙醇,擦干桌面,寫實驗報告。
10. 觀察平板上長出的菌落克隆,以菌落之間能互相分開為好。注意白色菌斑。
轉化細胞實驗材料;
1. 器材
旋渦混合器,微量移液取樣器,移液器吸頭,1.5 ml 微量離心管,雙面微量離心管架,干式恒溫氣浴(或恒溫水浴鍋),制冰機,恒溫搖床,培養皿(已鋪好固體LB-Amp),超凈工作臺,酒精燈,玻璃涂棒,恒溫培養箱。
2. 試劑
培養基(不加抗菌素),LB培養基(加抗菌素),無菌ddH2O,IPTG,X-gal。
3. 材料處理
無菌ddH2O,1.5 ml 離心管裝入鋁制飯盒(滅菌)、移液器吸頭裝入相應的吸頭盒(滅菌),20%IPTG(M/V),2% X-gal(M/V,用N,N-二甲基甲酰胺配)。