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?PCR反應體系的組成與反應條件的優化
2024-8-5 閱讀(147)
PCR反應體系由反應緩沖液(10×PCR Buffer)、脫氧核苷三磷酸底物(dNTPmix)、耐熱DNA聚合酶(Taq酶)、寡聚核苷酸引物(Primer1，Primer2)、靶序列(DNA模板)五部分組成。各個組份都能影響PCR結果的好壞。
1. 反應緩沖液：一般隨Taq DNA聚合酶供應。標準緩沖液含：50mM KCl，10mM Tris-HCl(pH8.3室溫)，1.5mM MgCl2。Mg2+的濃度對反應的特異性及產量有著顯著影響。濃度過高，使反應特異性降低；濃度過低，使產物減少。在各種單核苷酸濃度為200μM時，Mg2+為1.5mM較合適。若樣品中含EDTA或其它螯合物，可適當增加Mg2+的濃度。在高濃度DNA及dNTP條件下進行反應時，也必須相應調節Mg2+的濃度。據經驗，一般以1.5-2mM(終濃度)較好。
2. dNTP ：高濃度dNTP易產生錯誤摻入，過高則可能不擴增；但濃度過低，將降低反應產物的產量。PCR中常用終濃度為50-400μM的dNTP。四種脫氧三磷酸核苷酸的濃度應相同，如果其中任何一種的濃度明顯不同于其它幾種時(偏高或偏低)，就會誘發聚合酶的錯誤摻入作用，降低合成速度，過早終止延伸反應。此外，dNTP能與Mg2+結合，使游離的Mg2+濃度降低。因此，dNTP的濃度直接影響到反應中起重要作用的Mg2+濃度。
3. Taq DNA聚合酶酶：在100μl反應體系中，一般加入2-4U的酶量，足以達到每min延伸1000-4000個核苷酸的摻入速度。酶量過多將導致產生非特異性產物。但是，不同的公司或不同批次的產品常有很大的差異，由于酶的濃度對PCR反應影響極大，因此應當作預試驗或使用廠家推薦的濃度。當降低反應體積時(如20μl或50μl)，一般酶的用量仍不小于2U，否則反應效率將降低。
4. 引物：引物是決定PCR結果的關鍵，引物設計在PCR反應中極為重要。要保證PCR反應能準確、特異、有效地對模板DNA進行擴增，通常引物設計要遵循以下幾條原則：
⑴ 引物的長度以15-30bp為宜，一般(G+C)的含量在45-55%，Tm值高于55℃[Tm=4(G+C)+2(A+T)]。應盡量避免數個嘌呤或嘧啶的連續排列，堿基的分布應表現出是隨機的。
⑵ 引物的3’端不應與引物內部有互補，避免引物內部形成二級結構，兩個引物在3’端不應出現同源性，以免形成引物二聚體。3’端末位堿基在很大程度上影響著Taq酶的延伸效率。兩條引物間配對堿基數少于5個，引物自身配對若形成莖環結構，莖的堿基對數不能超過3個由于影響引物設計的因素比較多，現常常利用計算機輔助設計。
⑶ 人工合成的寡聚核苷酸引物需經PAGE或離子交換HPLC進行純化。
⑷ 引物濃度不宜偏高，濃度過高有兩個弊端：一是容易形成引物二聚體(primer-dimer)，二是當擴增微量靶序列并且起始材料又比較粗時，容易產生非特異性產物。一般說來，用低濃度引物不僅經濟，而且反應特異性也較好。一般用0.25-0.5pM/μl較好。
⑸ 引物一般用TE配制成較高濃度的母液(約100μM)，保存于-20℃。使用前取出其中一部分用ddH2O配制成10μM或20μM的工作液。
5. 模板：PCR對模板的要求不高，單、雙鏈DNA均可作為PCR的樣品。雖然PCR可以用極微量的樣品(甚至是來自單一細胞的DNA)作為摸板，但為了保證反應的特異性，一般還宜用μg水平的基因組DNA或104拷貝的待擴增片段作為起始材料。原材料可以是粗制品，某些材料甚至僅需用溶劑一步提取之后即可用于擴增，但混有任何蛋白酶、核酸酶、Taq DNA聚合酶抑制劑以及能結合DNA的蛋白，將可能干擾PCR反應。
6. PCR循環加快，即相對減少變性、復性、延伸的時間，可增加產物的特異性
