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細胞傳代培養消化法具體操作步驟
2024-6-18 閱讀(66)
當培養的細胞增殖達到一定密度后，將會出現密度抑制現象，表現為細胞的生長和分裂速度逐漸減慢，甚至停止。此時如果不及時進行分裝再培養，即傳代培養，細胞將逐漸走向衰老、死亡。將培養的細胞從一個容器以1∶2或其他比率轉移到其他容器中擴大培養，稱為傳代培養。
細胞傳代培養消化法具體操作步驟：
一、傳代前準備：
1.預熱培養用液：把已經配制好的裝有培養液、PBS液和yi蛋白酶的瓶子放入37℃水浴鍋內預熱。
2.用75%酒精擦拭經過紫外線照射的超凈工作臺和雙手。
3.正確擺放使用的器械：保證足夠的操作空間，不僅便于操作而且可減少污染。
4.點燃酒精燈：注意火焰不能太小。
5.準備好將要使用的消毒后的空培養瓶，放入微波爐內高火，8分鐘再次消毒。
6.取出預熱好的培養用液：取出已經預熱好的培養用液，用酒精棉球擦拭好后方能放入超凈臺內。
7.從培養箱內取出細胞：注意取出細胞時要旋緊瓶蓋，用酒精棉球擦拭顯微鏡的臺面，再在鏡下觀察細胞。
8.打開瓶口：將各瓶口一一打開，同時要在酒精燈上燒口消毒。
二、yi 蛋白酶消化
1.加入消化液：小心吸出舊培養液，用PBS清洗(沖洗)，加入適量消化液(yi蛋白酶液)，注意消化液的量以蓋住細胞最好，最佳消化溫度是37℃。
2.顯微鏡下觀察細胞：倒置顯微鏡下觀察消化細胞，若胞質回縮，細胞之間不再連接成片，表明此時細胞消化適度。
3.吸棄消化液加入培養液：棄去yi 蛋白酶液，注意更換吸管，加入新鮮的培養液。
三、吹打分散細胞
1.吹打制懸：用滴管將已經消化細胞吹打成細胞懸液。
2.吸細胞懸液入離心管：將細胞懸液吸入10ml離心管中。
3.平衡離心：平衡后將離心管放入臺式離心機中，以1000轉/分鐘離心6～8分鐘。
4.棄上清液，加入新培養液：棄去上清液，加入2ml培養液，用滴管輕輕吹打細胞制成細胞懸液。
四、分裝稀釋細胞：
1.分裝：將細胞懸液吸出分裝至2-3個培養瓶中，加入適量培養基旋緊瓶蓋。
2.顯微鏡下觀察細胞：倒置顯微鏡下觀察細胞量，必要是計數。注意密度過小會影響傳代細胞的生長，傳代細胞的密度應該不低于5×105/ml。最后要做好標記。
五、繼續培養：
用酒精棉球擦拭培養瓶，適當旋松瓶蓋，放入CO2培養箱中繼續培養。傳代細胞2小時后開始貼附在瓶壁上。當生長細胞鋪展面積占培養瓶底面積25%時為一個+，占50%為++，占75%時為+++。
