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免疫熒光技術(IF)主要操作步驟
2024-3-4 閱讀(56)
免疫熒光技術（Immunofluorescence，IF）又稱熒光抗體技術，是標記免疫技術發展最早的一種，它是在免疫學、生物化學和顯微鏡技術的基礎上建立起來的一項技術，通過將抗體與一些示蹤物質結合，它利用抗原抗體特異性結合的原理先將已知抗體標上英光素以此作為探針檢查細胞或組織內的相應抗原在熒光顯微鏡下觀察。當抗原抗體復合物中的熒光素受激發光的照射后即會發出一定波長的熒光從而可確定組織中某種抗原的定位進而還可進行定量分析。由于免疫熒光技術特異性強、靈敏度高、快速簡便所以在臨床病理診斷、檢驗中應用較廣。
免疫熒光技術主要步驟:
1、冰凍切片制備:建議用新鮮組織否則組織細胞內部結構破壞易使抗原彌散。選用干凈鋒利的刀片、組織一定要冷凍適度等防止裂片和脫片。
2、組織切片固定切好片風干后立即用冰丙酮等固定液進行固定5-10min,尤其要較長時間保存的白片,一定要及時固定和適當保存。
3、血清封閉:為防止內源性非特異性蛋白抗原的結合需要在一抗孵音前先用血清(與二抗來源一致)封閉減弱背暴著色，血清封閉的時間是可以調整的一般10-30min。
4、一抗孵音條件在免疫組化反應中最重要包括孵育時間和抗體濃度。一抗孵查溫度有幾種4度、室溫。
37度其中4度效果更佳孵音時間這與溫度、抗體濃度有關一般37度1-2h4度過夜(從冰箱拿出后37度復溫45min)。具體條件還要摸索。
5、二抗孵育條件一般室溫或37度30min-1h具體時間需要摸索而濃度一般有工作液若是濃縮液還要摸索濃度一定要避光反應，但在免疫熒光中我們一般先把三抗濃度和孵育時間先定下然后去摸索一抗濃度和邦育時間。最后熒光素標記的二抗隨著保存時間的延長可能會有大星的游商熒光素殘留需要注意配制時小包裝和并進行適當的商心。
6、復染目的是形成細胞輪廊從而更好地對目標蛋白進行定位，一般常用DAPI復染。
7、封片:為了長期保存我們一般用緩沖甘油等封片，此外還有專門的抗熒光萃滅封片液。避免產生氣泡方法是直接在載玻片組織上滴一滴封片液然后一手拿住蓋片某一拐角，而另一手拿對面的那個拐角,接近封片液近端的拐角先降低直至接觸到液體時為止當發現液體接觸面在不斷彌散時則可以緩慢降低另一拐角這樣一般不會產生氣泡。
8、切片清洗:為了防止一抗、二抗等試劑殘留而引起非特異性染色所以適當地加強清洗(延長時間和增多次數)尤為重要一般在一抗孵育前的清洗是3min*3次而一抗孵育后的清洗均為5次*5min.
注意事項:
(1)單獨沖洗,防止交叉反應造成污染。
(2)溫柔沖洗,防止切片的脫落。我喜歡用浸洗方式。
(3)沖洗的時間要足夠,才能全洗去結合的物質。
(4)PBS的PH和離子強度的使用和要求(建議PH在7.4-7.6,濃度是0.01M;中性及弱堿性條件有利于免疫復合物的形成,而酸性條件則有利于分解;低離子強度有利于免疫復合物的形成,而高離子強度則有利于分解。
9、拍照有條件的話更好立即拍照若不能及時拍照也要封好片和用指甲油封固,保持避光和濕度。使用熒光顯微鏡注意嚴格按照熒光顯微鏡出廠說明書要求進行操作不要隨意改變程序應在暗室中進行檢查防止紫外線對眼睛的攝害在調救光源時應戴上防護眼鏡檢查時間每次以1~2h為宜超過90min.超高壓錄燈發光強度逐漸下降熒光減弱標本受紫外線照射3~5min后熒光也明顯減弱或褪色激發光長時間的照射,會發生熒光的衰減和淬滅現象:所以最多不得超過2~3h熒光顯微鏡光源壽命有限標本應集中檢查，以節省時間,保護光源。天熱時應加電扇散熱降溫新換燈泡應從開始就記錄使用時間。燈熄滅后欲再啟用時須待燈光充分冷卻后才能點燃。中應避免數次點燃光源。關閉汞燈至少在開啟15-30分鐘后標本染色后立即觀察因時間久了熒光會逐漸減弱。若將標本放在聚之烯塑料袋中4℃保存可延緩熒光減弱時間,防止封裱劑蒸發,使用的玻片等載體都必須厚度均勻無明顯的自發熒光如果使用油鏡還必須保證鏡油為無熒光鏡油電源更好裝穩壓器,否則電壓不穩不僅會降低汞燈的壽命也會影響鏡檢的效果。
