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列舉PCR引物設計的基本原則

2023-2-10  閱讀(74)

引物設計的原則:

1.引物長度:一般為15-30bp,常用的是18-27bp,但不能大于38,因為過長會導致其延伸溫度大于74℃,即Taq酶的最適溫度。

2.引物的特異性:引物與非特異擴增序列的同源性不要超過70%或有連續8個互補堿基同源。

3.序列Tm值:引物的Tm值一般控制在55-60度, 盡可能保證上下游引物的Tm值一致,一般不超過2度。退火溫度=4×(G+C)+2×(A+T)-(5~8)

4.G+C含量:有效引物中(G+C)的比例為40-60%,過高或過低都不利于引發反應。上下游引物的GC含量不能相差太大。

5. 引物的3′端:引物的延伸是從3′端開始的,不能進行任何修飾;引物3’端的堿基一般不用A,因為A在錯誤引發位點的引發效率相對比較高; 引物間3’端的互補、二聚體或發夾結構也可能導致PCR反應失敗

6.引物的5′端:引物的5′端限定著PCR產物的長度,它對擴增特異性影響不大。因此,可以被修飾而不影響擴增的特異性。引物5′端修飾包括:加酶切位點;標記生物su、熒光、di高辛、Eu3+等;引入蛋白質結合DNA序列;引入突變位點、插入與缺失突變序列和引入一啟動子序列等。 




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