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上海邦景實業有限公司
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詳解PCR反應循環參數
2022-9-13 閱讀(692)
循環次數 ：一般為25 ～ 30次。循環數決定PCR擴增的產量。模板初始濃度低，可增加循環數以便達到有效的 擴增量。但循環數并不是可以無限增加的。一般循環數為30個左右，循環數超過30個以后，DNA聚合酶活性逐漸達到飽和，產物的量不再隨循環數的增加而增加，出現了所謂的“平臺期"。
循環參數:
1.預變性
模板DNA*變性與PCR酶的*激活對PCR能否成功至關重要，建議加熱時間參考試劑說明書，一般未修飾的Taq酶激活時間為兩分鐘。
2.變性步驟
循環中一般95℃，30秒足以使各種靶DNA序列*變性，可能的情況下可縮短該步驟時間。變性時間過長損害酶活性，過短靶序列變性不*，易造成擴增失敗。
3.引物退火
退火溫度需要從多方面去決定，一般根據引物的Tm值為參考，根據擴增的長度適當下調作為退火溫度。然后在此次實驗基礎上做出預估。退火溫度對PCR的特異性有較大影響。
4.引物延伸
引物延伸一般在72℃進行（Taq酶最適溫度）。但在擴增長度較短且退火溫度較高時，本步驟可省略延伸時間隨擴增片段長短而定，一般推薦在1000bp以上，含Pfu及其衍生物的衍生設定為1min/kbp。
5.循環數
大多數PCR含25-35循環，過多易產生非特異擴增。
6.最后延伸
在最后一個循環后，反應在72℃維持10-30分鐘．使引物延伸*，并使單鏈產物退火成雙鏈。
