熒光素標記抗體技術原理：
目前用于抗體標記的熒光素主要有異硫氰酸熒光素(Fluorescein isothiocynate,FITC)或羅達明(Lissamine rhodamine B200, RB200)。在鹼性條件下FITC的碳酰胺鍵可與抗體賴氨酸的ε氨基共價結合，標記后的抗體仍保持與相應抗原結合的能力。在熒光燈源紫外線或蘭紫光激發下產生黃綠色熒光，通過在熒光顯微鏡下觀察或流式細胞儀分析可對相應抗原進行定性、定位或定量的檢測。
熒光素標記抗體注意事項：
（1）影響標記的因素主要有溫度、時間、pH及熒光素與抗體蛋白的量等。標記所需的時間與溫度呈反比，4℃需12-18h，20-25℃需2-4h；PH低，標記慢，但如pH大于10，抗體易變性，故pH以9.0-9.5為宜；抗體蛋白量低標記慢，以20mg/ml為宜；熒光素如使用FITC無定型粉末時，用量可稍大，如為結晶型，用量則應減少。
（2）標記抗體中如存在2×10-5mg/ml游離熒光素時即可產生非特異性熒光，故用Sephadex凝膠柱過濾時，上樣量不宜太多，一般上樣量小于柱床容積的1/2。
（3）免疫血清中的白蛋白易與熒光素結合，在每ml抗體溶液中白蛋白量為6.25×10-2mg/ml時，即可出現非特異性熒光。故待標記的抗體以用純化的抗體為好。
（4）半透膜法（Clark 法）適用于小量抗體的標記。標記效果比直接法均勻，非特異性染色較少，結合物中游離熒光素含量較低，易于*去除，但該法熒光素用量較大。
（5）用過的Sephadex凝膠柱常附有熒光素而難于除盡，可使用0.1mol/L HCl處理0.5h，再依次用蒸餾水、PBS流洗，平衡。
用于標記的抗體，要求是高特異性和高親和力的。所用抗血清中不應含有針對標本中正常組織的抗體。一般需經純化提取IgG后再作標記。作為應符合以下要求：①應具有能與蛋白質分子形成共價鍵的化學基團，與蛋白質結合后不易解離，而未結合的色素及其降解產物易于清除。②熒光效率高，與蛋白質結合后，仍能保持較高的熒光效率。③熒光色澤與背景組織的色澤對比鮮明。④與蛋白質結合后不影響蛋白質原有的生化與免疫性質。⑤標記方法簡單、安全無毒。⑥與蛋白質的結合物穩定，易于保存。
