魚腥藻毒素a 檢測試劑盒說明書
注意：在使用前請認真閱讀說明書（請以英文為準，中文僅供參考）
1、概述
ABR魚腥藻毒素a檢測試劑盒利用受體結合的原理。適用于定量或定性檢測水樣中魚腥藻毒素a的含量。其他樣品的提取步驟請與我公司。如果有必要陽性樣品可以通過HPLC, GC/MS或其他的傳統方法證實測定結果。
2、安全說明
標品中含有少量魚腥藻毒素a，底物中含有四甲基聯苯胺，終止液也含有稀硫酸。要避免接觸到皮膚和粘膜。如果不小心接觸了請用大量的水沖洗。
3、儲存和穩定性
魚腥藻毒素a檢測試劑盒應該保存在4–8°C。在使用之前試劑盒中的試劑要恢復到室溫（20-25°C）。試劑盒在有效期內可以使用。酶標物需要現配，配好的酶標物溶液只能在冰凍保存1周。4、原理
魚腥藻毒素a檢測試劑盒的原理是基于魚腥藻毒素a與受體結合的反應。如果樣品中含有魚腥藻毒素a，會與*標記的α-金環蛇毒素競爭受體（nAChRs）的結合位點，洗板后加入鏈霉親和素酶標物與*結合，再洗板加入底物顯色，溶液顏色深淺與魚腥藻毒素a的含量成反比。通過做標準曲線計算每個樣品中魚腥藻毒素a的含量。
5、魚腥藻毒素a 檢測試劑盒的限制和可能的干擾
樣品中的很多易出現的有機物和無機物已經被檢測表明對試劑盒的檢測沒有干擾。然而由于樣品中化合物的多變性引起的基質效應是不可能*避免的。魚腥藻毒素a在光照或者高pH條件下會降解，所以如果樣品暴露在光照或者高pH條件會造成魚腥藻毒素a含量偏低。后面有樣品處理部分，可以先看看如何合理處理樣品。在使用的過程中出現失誤也會影響結果，比如：試劑盒保存條件不對、錯誤的加液順序、試劑的量沒有加準確、孵育的時間太長或太短、孵育的溫度太高或太低（低于35°C或高于40°C），顯色反應溫度太高或太低（低于16°C或高于20°C）。和其它檢測方法一樣對陽性結果要求通過其它傳統的方法來驗證。
6、魚腥藻毒素a 檢測的重要性
魚腥藻毒素a是由藍藻產生的生物堿神經毒素。在藍藻毒素中 是zui毒的一種。人或者動物體內的肌肉神經接點是魚腥藻毒素a的一個靶標（魚腥藻毒素a也能穿過血腦屏障），肌肉神經接點把信息從突觸前的神經終端傳達到突觸后的肌肉，同時乙酰*會釋放出來，激活肌肉的乙酰*受體，激發一系列的事件是肌肉收縮。大部分的乙酰*會被肌肉神經接點處的乙酰*酯酶分解。魚腥藻毒素a作為一種乙酰*受體激動劑，效能是乙酰*的20倍，但不能被乙酰*酯酶分解，會使肌肉終板持續去極化，過度刺激肌肉，導致肌肉疲憊和麻痹。注射魚腥藻毒素a5分鐘，就會出現抽搐、心律失常、呼吸麻痹，zui后窒息而死。
人和動物可能會注射含有魚腥藻毒素a的針劑或者喝到含有魚腥藻毒素a的水而中毒。鑒于此毒素的危害，很多國家已經開始對水中的魚腥藻毒素a進行檢測。新西蘭規定魚腥藻毒素a的zui大可接受量為6.0ug/L。
魚腥藻毒素a檢測試劑盒可以檢測43個樣（雙樣），同時需要的樣品量幾個毫升，整個實驗可以在3.5
小時內完成。
工作指導
A 試劑盒組成（18）
1、96孔板：包被有乙酰*受體，1塊（12條×8孔）。
2、標品緩沖液：1瓶(6mL)。
3、樣品緩沖液：1瓶(6mL)。
4、魚腥藻毒素a標品：5瓶（1mL）0，5，25, 125，and 500 ng/mL (ppb)。
5、*標記的α-金環蛇毒素：1瓶（6mL）。
6、鏈霉親和素酶標物（HRP)：1瓶。
7、酶標物稀釋液：1瓶（12mL）
8、樣品稀釋液：1瓶（25ml）
9、5×濃縮洗液：1瓶（100ml）,使用前按比例稀釋
10、底物顯色液（TMB）:1瓶（16ml）
11、終止液：1瓶（12ml）。
B、試劑盒未提供的材料
1、微量移液器及一次性吸頭（(20-200 μL)
2、多道移液器（50-250ul）及吸頭
3、純凈蒸餾水
4、量筒
5、500ml容量瓶（用于配洗液）
6、保鮮膜
7、計時器
8、吸水紙巾
9、37°C孵育器
10、酶標儀（波長450nm）
C、樣品收集和處理
收集水樣放在棕色玻璃瓶冷藏，5天內檢測。樣品需要保存5天以上的要冰凍起來。不要把樣品暴露在自然或者人造光線中，因為光會使魚腥藻毒素a分解。不要用可以升高pH值的試劑來保存樣品。在提取或者濃縮樣品時可以調整pH值，短暫的暴露于高pH環境是不會對很嚴重的影響結果的，就是不要*的暴露于高pH環境。
如果總的魚腥藻毒素a（游離的和結合細胞的）都要檢測，檢測前先要用合適的方法（反復凍融，超聲波裂解等）使細胞裂解。
如果有機質太多先要過濾再檢測（如果檢測總的魚腥藻毒素a要先融解再過濾，否則可能過濾掉細胞結合的毒素）。
D、測試準備
1、微量移液器和吸頭是必須使用的，*使用排槍來添加結合物、底物和終止液，這樣可以保證整個酶標板的孵育時間一致。在做同一次測試時要使用同一個盒子里的試劑和標準。
2、使用前將所有的試劑拿到室溫（19℃-25℃）
3、板是由12條8孔的微孔組成，每次使用不要超過6條，要不可能出現飄移。一次檢測使用多于6條可能出不準確的結果。
4、從鋁箔袋中拿出要求數量的微孔條，放入干燥劑并重新封好袋子以免微孔條受潮。置于4-8℃保存。
5、標品液、緩沖液、*標記的阿爾法金環蛇毒素、底物和終止液可直接使用，無需再稀釋。
6、酶標物是凍干的（4瓶），每次檢測前計算好酶標物的用量，（1瓶可以夠用于30個孔個檢測）陪酶標物溶液時，1瓶加入3.5mL酶標稀釋液，震蕩混勻，新配好的酶標物溶液只能冰凍保存一個星期。如果一次用到多瓶，要把他們合并一起，用前混勻。
7、以1：5的比例稀釋洗液（如果要使用一整瓶那么100ml洗液+ 400ml蒸餾水或無離子水）。
8、由于終止液中包含酸，拿的時候要小心。
E、工作計劃
板是由12條8孔的微孔組成，每次使用不要超過6條，要不可能出現飄移。一次檢測使用多于6條可能出不準確的結果。每次檢測都要用同一次的標準曲線，不能用之前的標準曲線。
Std 0-Std 4: 標準(Std 0-Std 4: 0; 5; 25; 125; 500ppb）
Sam1, Sam2, etc.: 樣品
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A Std0 Std4 etc
B Std0 Std4 etc
C Std1 Sam1
D Std1 Sam1
E Std2 Sam2
F Std2 Sam2
G Std3 Sam3
H Std3 Sam3
F、檢測步驟
使用前將試劑盒和樣品處理物提前從冰箱中拿出來使其達到室溫。從鋁箔袋中拿出要求數量的微孔條，放入干燥劑并重新封好袋子以免微孔條受潮。
1、在對應的微孔中分別加入25μL標準緩沖液或者樣品緩沖液。
2、在對應測試孔加入100 μL 標品溶液和樣品。輕輕敲打或者來回移動來混勻，用保鮮膜蓋好板，37°C孵育2小時。
3、每個測試孔加入50μL*標記的阿爾法金環蛇毒素，用膠帶蓋上，輕微擺動酶標板30s混合液體；在37°C下孵育30分鐘。
4、孵育完成后，將微孔中的溶液倒入水槽中，用250μL1x洗液洗板，然后倒掉，拍板，去掉殘留的洗液，洗板3次。
5、每個測試孔加入100μL酶標溶液。輕微擺動酶標板30s混合液體；在37°C下孵育30分鐘，避免陽光直射。
6、孵育完成后，將微孔中的溶液倒入水槽中，用250μL1x洗液洗板，然后倒掉，拍板，去掉殘留的洗液，洗板3次。
7、每個測試孔加入150μL底物，輕微擺動酶標板30s混合液體；在室溫下孵育30分鐘，避免陽光直射。
8、每個測試孔加入100μL終止液。
9、輕微擺動酶標板10s混合液體，450nm 下讀取每個孔的吸光度值（OD）。
G、結果分析
可以利用商業ELISA軟件程序比如Logit/Log or 4-Parameter 來評價ELISA結果。也可以通過計算每個標準的%B/B0值，以%B/B0為y軸、魚腥藻毒素a濃度為x軸作一標準曲線。樣品濃度可以通過標準曲線來計算。當樣品中魚腥藻毒素a的濃度小于標準1（5ppb） 時，水樣結果即為<5ppb；當樣品中魚腥藻毒素a的濃度大于標準4（500ppb）時，水樣結果即為>500ppb,。樣品需要進一步稀釋后再測定。
H、操作數據
檢測限
魚腥藻毒素a的檢測限約為2.3 ng/mL(90% B/B0)。中間濃度約為87.4 ng/mL.(50% B/B0)，檢測值出于中間的位置比較可靠。
試劑盒的范圍是5 ng/mL 到500 ng/mL，如果所直接檢測的樣品的濃度在一個更低的范圍(0.25 ng/mL到25 ng/mL )，則需要進行濃縮固相萃取，相關技術方法請咨詢我司。
