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上海莼試生物技術有限公司
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鼠抗人b淀粉樣蛋白單克隆抗體技術原理
2022-6-14 閱讀(176)
一、 原理
與Southern或Northern雜交方法類似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測物是蛋白質，“探針"是抗體，“顯色"用標記的二抗。經過PAGE分離的蛋白質樣品，轉移到固相載體（例如硝#纖維素薄膜）上，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學活性不變。以固相載體上的蛋白質或多肽作為抗原，與對應的抗體起免疫反應，再與酶或同位素標記的第二抗體起反應，經過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達的蛋白成分。該技術也廣泛應用于檢測蛋白水平的表達。
二、分類
現常用的有底物化學發光ECL和底物DAB呈色，體同水平和實驗條件的是用*種方法，目前發表文章通常是用底物化學發光ECL。只要買現成的試劑盒就行，操作也比較簡單，原理如下（二抗用HRP標記）：反應底物為過氧化物+魯米諾，如遇到HRP，即發光，可使膠片曝光，就可洗出條帶。
三、主要試劑鼠抗人單克隆抗體 BLA.36 、 丙烯酰胺和N，N’-亞甲雙丙烯酰胺，應以溫熱（以利于溶解雙丙稀酰胺）的去離子水配制含有29%（w/v）丙稀酰胺和%（w/v）N，N’-亞甲雙丙烯酰胺儲存液丙稀酰胺29g，N，N-亞甲叉雙丙稀酰胺g，加H2O至 00ml。）儲于棕色瓶，4℃避光保存。嚴格核實PH不得超過7.0，因可以發生脫氨基反應是光催化或堿催化的。使用期不得超過兩個月，隔幾個月須重新配制。如有沉淀，可以過濾。
2、 十二烷基硫#鈉SDS溶液:0%（w/v）0.gSDS，mlH2O去離子水配制，室溫保存。
3、 分離膠緩沖液:.5mmol/L Tris-HCl （pH8.8）:8.5gTris和48mlmol/L HCl 混合，加水稀釋到 BLA.36 4、 濃縮膠緩沖液:0.5mmol/L Tris-HCl （pH6.8）:6.05gTris溶于40mlH2O中，用約48ml mol/L HCl調至pH6.8加水稀釋到00ml終體積。過濾后40C保存。這兩種緩沖液必須使用Tris堿制備，再用HCL調節PH值，而不用 Tris.CL。
5、 TEMED原溶液N，N，N’N’四甲基乙二胺催化過硫#銨形成自由基而加速兩種丙稀酰胺的聚合。PH太低時，聚合反應受到抑制。0%（w/v）過硫#胺溶液。提供兩種丙稀酰胺聚合所必須的自由基。去離子水配制數ml，臨用前配制.
