人血漿α顆粒膜蛋白（GMP-140）定量檢測(cè)試劑盒【檢測(cè)原理】

本試劑盒采用雙抗體一步夾心酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）。將標(biāo)準(zhǔn)品、待測(cè)樣本和酶標(biāo)工作液加入到預(yù)先包被人血漿α顆粒膜蛋白（GMP-140）抗體的透明酶標(biāo)包被板中，溫育足夠時(shí)間后，洗滌除去未結(jié)合的成分。依次加入顯色劑A、B液，顯色劑（TMB）在辣根過(guò)氧化物酶（HRP）催化下轉(zhuǎn)化為藍(lán)色產(chǎn)物，在酸的作用下變成黃色，顏色的深淺與樣品中人血漿α顆粒膜蛋白（GMP-140）濃度呈正相關(guān)，450nm波長(zhǎng)下測(cè)定OD值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的OD值，計(jì)算樣本中人血漿α顆粒膜蛋白（GMP-140）含量。

【試劑盒組成】

1

酶標(biāo)包被板

12孔×8條

7

顯色劑A液

6mL

2

標(biāo)準(zhǔn)品：24ng/ml

0.6mL

8

顯色劑B液

6mL

3

20倍濃縮洗滌液

25mL

9

終止液

6mL

4

標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液

6mL

10

說(shuō)明書(shū)

1份

5

*

6mL

11

封板膜

2張

6

人血漿α顆粒膜蛋白（GMP-140）定量檢測(cè)試劑盒酶標(biāo)試劑

10mL

12

密封袋

1個(gè)

備注：標(biāo)準(zhǔn)品用標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液依次稀釋為：24、12、6、3、1.5、0.75 ng/ml

【需要而未提供的試劑和器材】

1、37℃恒溫箱

2、標(biāo)準(zhǔn)規(guī)格酶標(biāo)儀

3、精密移液器及一次性吸頭

4、蒸餾水

5、一次性試管

6、吸水紙

【操作步驟】

1、準(zhǔn)備：從冰箱取出試劑盒，室溫復(fù)溫平衡30分鐘。

2、配液：用蒸餾水將20倍濃縮洗滌液稀釋成原倍的洗滌液。

3、加標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣本：取足夠數(shù)量的酶標(biāo)包被板，固定于框架上，分別設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔、待測(cè)樣本孔和空白對(duì)照孔，記錄各孔位置，在標(biāo)準(zhǔn)品孔中加入標(biāo)準(zhǔn)品50μL；待測(cè)樣本孔中先加入待測(cè)樣本10μL，再加*40μL（即樣本稀釋5倍）；每孔再加入酶標(biāo)工作液100μL；空白對(duì)照孔不加。

4、溫育：37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。

5、洗板：棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿(mǎn)洗滌液，靜置1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板5次（也可用洗板機(jī)按說(shuō)明書(shū)操作洗板）。

6、顯色：每孔先加入顯色劑A 液50μL，再加入顯色劑B液 50μL，37℃避光顯色15min。

7、終止：取出酶標(biāo)板，每孔加終止液50μL，終止反應(yīng)（顏色由藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）。

8、測(cè)定：以空白孔調(diào)零，在終止后15分鐘內(nèi)，用450nm波長(zhǎng)測(cè)量各孔的吸光值（OD值）。

9、計(jì)算：根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度及對(duì)應(yīng)的OD值，計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程，再根據(jù)樣本的OD值，在回歸方程上計(jì)算出對(duì)應(yīng)的樣品濃度，也可以使用各種應(yīng)用軟件來(lái)計(jì)算。zui終濃度為實(shí)際測(cè)定濃度乘以稀釋倍數(shù)。

【樣本要求】

1、樣本不能含疊氮鈉（NaN3），因?yàn)榀B氮鈉（NaN3）是辣根過(guò)氧化物酶（HRP）的抑制劑。

2、標(biāo)本采集后盡早進(jìn)行提取，提取按相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行，提取后應(yīng)盡快進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。若不能立即試驗(yàn)，可將標(biāo)本放于-20℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

3、樣本應(yīng)充分離心，不得有溶血及顆粒。

【注意事項(xiàng)】

1、實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)的操作進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)結(jié)果判定必須以酶標(biāo)儀讀數(shù)為準(zhǔn)。

2、酶標(biāo)包被板開(kāi)封后如未用完，應(yīng)立即裝入密封袋中加干燥劑保存。

3、建議所有的標(biāo)準(zhǔn)品、樣本和空白對(duì)照都做雙份檢測(cè)，取平均值，以減小實(shí)驗(yàn)誤差。

4、若顯色過(guò)淺，可適當(dāng)延長(zhǎng)底物溫育時(shí)間。

5、為避免交叉污染，標(biāo)準(zhǔn)品、樣本和空白對(duì)照每加一個(gè)就要更換一次吸頭；酶標(biāo)工作液、*和底物等公共組分，要懸臂加樣，不得碰到微孔；不得重復(fù)使用封板膜。

6、試劑盒保質(zhì)期內(nèi)使用，不同批號(hào)的試劑不得混用。

7、人血漿α顆粒膜蛋白（GMP-140）定量檢測(cè)試劑盒底物B對(duì)光敏感，避免長(zhǎng)時(shí)間暴露于光下。