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江蘇菲亞生物科技有限公司
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細胞凋亡的檢測方法
2017-3-9 閱讀(799)
一、形態學觀察方法
1、HE染色、光鏡觀察：凋亡細胞呈圓形，胞核深染，胞質濃縮，染色質成團塊狀，細胞表面有“出芽”現象。
2、丫啶橙（AO）染色，熒光顯微鏡觀察：活細胞核呈黃綠色熒光，胞質呈紅色熒光。凋亡細胞核染色質呈黃綠色濃聚在核膜內側，可見細胞膜呈泡狀膨出及凋亡小體。
3、臺盼藍染色：如果細胞膜不完整、破裂，臺盼藍染料進入細胞，細胞變藍，即為壞死。如果細胞膜完整，細胞不為臺盼藍染色，則為正常細胞或凋亡細胞。此方法對反映細胞膜的完整性，區別壞死細胞有一定的幫助。
4、透射電鏡觀察：可見凋亡細胞表面微絨毛消失，核染色質固縮、邊集，常呈新月形，核膜皺褶，胞質緊實，細胞器集中，胞膜起泡或出“芽”及凋亡小體和凋亡小體被臨近巨噬細胞吞噬現象。
二、DNA凝膠電泳
（一）、檢測原理
細胞發生凋亡或壞死，其細胞DNA均發生斷裂，細胞內小分子量DNA片斷增加，高分子DNA減少，胞質內出現DNA片斷。但凋亡細胞DNA斷裂點均有規律的發生在核小體之間，出現180－200bpDNA片斷，而壞死細胞的DNA斷裂點為無特征的雜亂片斷，利用此特征可以確定群體細胞的死亡，并可與壞死細胞區別。
（二）結果判斷
正常活細胞DNA電泳出現階梯狀（LADDER）條帶；壞死細胞DNA電泳類似血抹片時的連續性條帶。
三、酶聯免疫吸附法（ELISA）核小體測定
凋亡細胞的DNA斷裂使細胞質內出現核小體。核小體由組蛋白及其伴隨的DNA片斷組成，可由ELISA法檢測。
（一）檢測步驟
1、將凋亡細胞裂解后高速離心，其上清液中含有核小體；
2、在微定量板上吸附組蛋白體’
3、加上清夜使抗組蛋白抗體與核小體上的組蛋白結合‘
4、加辣過氧化物酶標記的抗DNA抗體使之與核小體上的DNA結合’
4、加酶的底物，測光吸收制。
（二）用途
該法敏感性高，可檢測5*100/ml個凋亡細胞。可用于人、大鼠、小鼠的凋亡檢測。
四、流式細胞儀定量分析
（一）檢測原理
細胞發生凋亡時，其細胞膜的通透性也增加，但是其程度介于正常細胞與壞死細胞之間。
（二）應用價值
流式細胞儀檢測具有以下特點：
1）、檢測的細胞數量大，因此其反映群體細胞的凋亡狀態比較準確
2）、可以做許多相關性分析
3）、結合被檢測細胞的DNA含量的分析，可確定凋亡的細胞所處的細胞周期
■檢測形態學及細胞膜完整性的Hoechs-PI雙染色法
細胞發生凋亡時，其細胞膜的通透性液增加，但其程度介于正常細胞和壞死細胞之間，利用這一特點，被檢測細胞懸液用熒光素染色，利用流式細胞儀檢測細胞懸液中細胞熒光強度來區分正常細胞、壞死細胞和凋亡細胞。
■DNA片斷原位標記法
凋亡細胞DNA片斷原位末端檢測技術是指在細胞（或組織）結構保持不變的情況下，用熒光素、生物素標記的脫氧尿三磷酸（deoxyuridinetriphate，DUTP）和末端脫氧核苷酸轉移酶（TdT）相反應與凋亡細胞裂解后3·的羥基（－OH）端結合，經顯色反應后檢測DNA裂解點的技術。
DNA片段原位標記法有二種：
1、原位缺口轉移（insitunick-translation,ISNT）技術，它是利用DNA多聚酶I將標記的核苷酸連接到斷裂DNA的3·－OH端
2、原位缺口末端標記技術（insituendlabellingtechnique,ISEL），即TUNEL法，它是利用TdT將標記的DUPT接到3·-OH端。研究證明，TUNEL法的敏感性遠高于ISNT，尤其對早期凋亡的檢測，TUNEL更為合適。
■檢測細胞膜成分變化的AnnexinV聯合PI法
1、原理：在細胞凋亡早期位于細胞膜內側的磷脂酰絲氨酸（PS）遷移至細胞膜外測。磷脂結合蛋白V（AnnexinV）是一種鈣依賴性的磷脂結合蛋白，它于PS具有高度的結合力。因此，AnnexinV可以作為探針檢測暴露在細胞外測的磷脂酰絲氨酸。故利用對PS有高度親和力的AnnexinV，將AnnexinV標記上熒光素（如異硫氰酸熒光素FITC），同時結合使用PI拒染法（因壞死細胞PS亦暴露于細胞膜外測，且對PI高染）進行凋亡細胞雙染法后用流式細胞儀即可檢測凋亡細胞。
2、結果判斷：正常活細胞AnnexinV、PI均低染；凋亡細胞AnnexinV高染、PI低染；壞死細胞AnnexinV/PI均高染。
3、應用價值：細胞發生凋亡時，膜上的PS外露早于DNA斷裂發生，因此AnnexinV聯合PI染色法檢測早期細胞凋亡較TUNEL法更為靈敏。又AnnexinV聯合PI染色不需固定細胞，可避免PI染色因固定造成的細胞碎片過多及TUNEL法因固定出現的DNA片段丟失。
