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培養(yǎng)細胞遺傳學(xué)的檢測技術(shù)
2017-3-9 閱讀(924)
細胞培養(yǎng)是體外研究細胞生物學(xué)性狀、遺傳學(xué)及分子生物學(xué)特性zui直接有效的手段。培養(yǎng)細胞遺傳學(xué)的主要檢測技術(shù)，包括性染色體的檢測、染色體顯示、染色體顯帶及染色體基因定位等。對培養(yǎng)細胞的分子生物學(xué)檢測主要包括細胞DNA檢測、RNA檢測及蛋白質(zhì)的檢測，而相關(guān)的生物學(xué)檢測主要包括細胞酶學(xué)檢測及細胞凋亡的檢測。
組織培養(yǎng)細胞是研究細胞遺傳zui便利、zui有效的方法和對象；也是揭示培養(yǎng)細胞性狀的重要方面。人二倍體細胞具有46條染色體數(shù)就是用細胞培養(yǎng)法所確定出來的。當(dāng)前已發(fā)展出染色體分帶、姊妹染色單體分化染色、染色體原位雜交等多種技術(shù)。近年染色體熒光基因標(biāo)記法又獲得迅速發(fā)展，使基因作為實體得以在染色體上顯現(xiàn)，從而*染色體和分子遺傳學(xué)之間的空白。染色體的研究已成為組織培養(yǎng)技術(shù)中重要組成部分。
一、性染色體檢測
(一)原理
在間期細胞核中，女性x染色質(zhì)和男性Y染色質(zhì)均可用特殊染色法顯示出來。女性的兩個x染色體中的一個，在間期時的染色質(zhì)呈異固縮(heteropycnosis)，呈深染的小體稱Barr氏體(圖9—1)。Barr氏體位于問期細胞核內(nèi)面，呈三角形或半月形小體，易為碳酸復(fù)葒等染料著色。正常女性Barr氏體陽性，男性為陰性。男性Y染色質(zhì)位于間期細胞核近中央部，易為鹽酸阿的平著色，熒光顯微鏡下觀察發(fā)較強熒光，呈點狀小體，發(fā)光部分系Y姿色體異固縮的長臂。初代培養(yǎng)細胞和二倍體細胞株均可觀察到性染色質(zhì)，傳代細胞系表現(xiàn)不規(guī)律。
(二)方法
1.碳酸復(fù)紅(basic fuchsin)顯示x染色質(zhì)法
(1)材料：蓋玻片培養(yǎng)的細胞。
(2)染色液
儲存液：稱堿性復(fù)紅3g，溶于1OOml 70％乙醇中，可長期保存。
工作液：(現(xiàn)用現(xiàn)配)
儲存液 10．0ml
5％石炭酸水溶液 90．0ml
冰醋酸 10．0 ml
甲醛(40％) 10．0ml
(3)染色步驟
1)細胞：蓋玻片培養(yǎng)細胞用37℃的BSS漂洗后，立即投入染色液內(nèi)染色5～lOmin(亦可先固定再染色)；如用涂片標(biāo)本則應(yīng)待涂片干后，迅速投入96％酒精固定10～15min后再染色。
2)分化：用96％酒精分化lmin，分化時要不斷搖動，把片子上多余的染料漂洗掉。
3)脫水：通過純酒精lmin。
4)封片：二甲苯透明2~3min，樹膠封固。
(4)結(jié)果：細胞質(zhì)不著色，細胞核染成紫紅色；陽性Barr氏體附于細胞核膜內(nèi)面呈三角或半月形小體。
2．熒光染色顯不Y染色質(zhì)法
(1)材料：蓋玻片培養(yǎng)的細胞。
(2)染色液
PBS(pH5．5～6．6) 100．0ml
鹽酸阿的平(atebrine) 0．2g
(3)染色步驟：Y染色質(zhì)顯示染色與染色體熒光顯帶法相同。
(4)結(jié)果：在熒光顯微鏡下觀察，Y染色質(zhì)呈特別明亮黃綠色熒光圓點，直徑0．25～ 0．3μm，可位于核內(nèi)任何位置，但以近中央時居多。
