*過氧化物酶（glutathione peroxidase, GSH-Px）說明書
分光光度法 50 管/48 樣
注意：正式測(cè)定之前選擇 2-3 個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。
測(cè)定意義：
GSH-Px 是*氧化還原循環(huán)中催化還原型*（GSH）氧化的主要酶之一。GSH-Px不僅能夠特異地催化還原型*與 ROS 反應(yīng)，生成氧化型* GSSG，從而保護(hù)生物膜免受 ROS 的損害，維持細(xì)胞的正常功能；而且具有保護(hù)肝臟、提高機(jī)體免疫力、拮抗有害金屬離子對(duì)機(jī)體的傷害和增加機(jī)體抗輻射等能力。
測(cè)定原理：
GSH-Px 催化 H2O2 氧化 GSH，產(chǎn)生 GSSG；*還原酶（GR）催化 NADPH 還原 GSSG，再生 GSH，同時(shí) NADPH 氧化生成 NADP+；NADPH 在 340 nm 有特征吸收峰，而 NADP+ 沒有；通過測(cè)定 340 nm 光吸收減少速率來計(jì)算 GSH-Px 活性。
自備儀器和用品：
紫外分光光度計(jì)、低溫離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)節(jié)移液器、1mL 石英比色皿和蒸餾水。
試劑組成和配置：
試劑一：液體×1 瓶，室溫保存。
試劑二：粉劑×1 瓶，4℃保存。
試劑三：液體×1 支，-20℃保存。
混合試劑配制：臨用前，在試劑二中加入試劑一 40 mL，充分震蕩溶解后加入全部試劑三，
混勻。（注意：必須現(xiàn)配現(xiàn)用，當(dāng)天使用完）
試劑四：液體×1 瓶，4℃保存。
粗酶液提取：
1. 組織：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1mL 試劑一）進(jìn)行冰浴勻漿。8000g，4℃離心 10min，取上清置冰上待測(cè)。
2. 細(xì)菌、真菌：按照細(xì)胞數(shù)量（104 個(gè)）：試劑一體積（mL）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細(xì)胞加入 1mL 試劑一），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率 300w，超聲 3 秒，間隔 7 秒，總時(shí)間 3min）；然后 8000g，4℃，離心 10min，取上清置于冰上待測(cè)。
3. 血清等液體：直接測(cè)定。
測(cè)定操作：
1. 分光光度計(jì)預(yù)熱 30 min，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到 340 nm，蒸餾水調(diào)零。
2. 混合試劑在 25℃或者 37℃（哺乳動(dòng)物）水浴中預(yù)熱 30min。
3. 空白管：依次在 1mL 石英比色皿中加入 100μL 蒸餾水、800μL 預(yù)熱的混合試劑，100μL試劑四，迅速混勻后于 340nm 處測(cè)定第 10 s 和第 190s 的吸光值，分別記為 A 空 1 和 A 空，
△A 空白管= A 空 1﹣A 空 2。
4. 測(cè)定管：依次在 1mL 石英比色皿中加入 100μL 上清液、800μL 預(yù)熱的混合試劑，100μL試劑四，迅速混勻后于 340nm 處測(cè)定第 10 s 和第 190s 的吸光值，分別記為 A 測(cè) 1 和 A 測(cè) 2，
△A 測(cè)定管= A 測(cè) 1﹣A 測(cè) 2。
注意：空白管只需要測(cè)定一次。
計(jì)算公式：
(1). 按蛋白濃度計(jì)算
GSH-Px 活力單位定義：一定溫度中，每 mg 蛋白每分鐘催化 1nmol NADPH 氧化為 1 個(gè)酶活單位。
GSH-Px (nmol/min/mg prot)=[(△A 測(cè)定管-△A 空白管)÷ε÷d×V 反總×109]÷（Cpr×V 樣）÷T =536×(△A 測(cè)定管-△A 空白管)÷Cpr
(2). 按樣本質(zhì)量計(jì)算
GSH-Px 活力單位定義：一定溫度中，每 g 樣本每分鐘催化 1nmol NADPH 氧化為 1 個(gè)酶活單位。
GSH-Px (nmol/min/g)=[(△A 測(cè)定管-△A 空白管)÷ε÷d×V 反總×109]÷(W×V 樣÷V 樣總)÷T =536×(△A 測(cè)定管-△A 空白管)÷W
（3）按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算
活性單位定義：一定溫度中，每 104 個(gè)細(xì)胞每分鐘催化 1nmol NADPH 氧化為 1 個(gè)酶活單位。 GSH-Px (nmol/min/104 cell)= [(△A 測(cè)定管-△A 空白管)÷ε÷d×V 反總×109]÷(細(xì)胞數(shù)量×V 樣÷V
樣總)÷T
=536×(△A 測(cè)定管-△A 空白管)÷細(xì)胞數(shù)量
（4）按液體體積計(jì)算
活性單位定義：一定溫度中，每毫升液體每分鐘催化 1nmol NADPH 氧化為 1 個(gè)酶活單位。
GSH-Px (nmol/min/mL)=[(△A 測(cè)定管-△A 空白管)÷ε÷d×V 反總×109]÷V 樣÷T
=536×(△A 測(cè)定管-△A 空白管)
ε：NADPH 摩爾消光系數(shù) 6.22×103L/mol/cm；V 反總：反應(yīng)體系總體積，1000μL=0.001 L；
106：1mol=1×106μmol； Cpr：上清液蛋白濃度（mg/mL）；V 樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積，100μL =0.1 mL；V 樣總：加入提取液體積，1mL；W，樣本質(zhì)量，g；T：反應(yīng)時(shí)間，3 min。
注意事項(xiàng)：
（1）樣品處理等過程均需要在冰上進(jìn)行，且須在當(dāng)日測(cè)定酶活力；
（2）混合試劑和底物液須臨用前配制，配完后置于冰上，當(dāng)天使用完；
（3）測(cè)定過程操作須迅速；
（4）細(xì)胞中 GSH-Px 活性測(cè)定時(shí)，細(xì)胞數(shù)目須在 300 萬-500 萬之間，細(xì)胞中 GSH-Px 的提取時(shí)可加試劑一后研磨或超聲波處理，不能用細(xì)胞裂解液處理細(xì)胞。
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