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上海鈺博生物科技有限公司
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閱讀：227發(fā)布時間：2018-1-23
1. LB培養(yǎng)基
2. PEG/NaCl
3. TBS
4. 0.1M NaHCO3（pH8.6）
5. HRP底物緩沖液
6. ABTS貯存液：在100ml 50mM的檸檬酸鈉溶液（pH4.0）中溶解22mgABTS，過濾除菌貯存在4℃。
1. 酶標板，酶標儀
2. 濕盒
3. 吸水紙
1. 噬斑擴增上清部分用于DNA序列測定，其余保存于4℃。
2. 將ER2537接種至20ml LB培養(yǎng)基中，37℃孵育至輕微混濁，或?qū)⑦^夜培養(yǎng)的ER2537按1：100稀釋至20ml。
3. 加入5ml噬菌體上清，37℃劇烈通氣培養(yǎng)4.5h。
4. 將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)入離心管，10，000轉(zhuǎn)離心10min。取上清轉(zhuǎn)入新的離心管，再次離心。
5. 吸取上層80%的上清轉(zhuǎn)入新離心管中，加入1/6體積的PEG/NaCl，4℃沉淀1h或過夜。
6. 4℃，10，000轉(zhuǎn)離心PEG沉淀物15min。傾去上清，再次短暫離心，吸去殘留上清。
7. 用1ml TBS懸浮沉淀物，并轉(zhuǎn)至微量離心管中，4℃離心5min以沉淀殘留細胞。
8. 將上清轉(zhuǎn)至新離心管中，再次用1/6體積的PEG/NaCl沉淀噬菌體。冰上孵育15~60min，4℃離心10min。傾去上清，再次短暫離心，吸去殘留上清。
9. 用50ml TBS懸浮沉淀物。測定滴度，貯存于4℃。
10. 取100~200ml溶于0.1M NaHCO3（pH8.6）的100mg/ml靶蛋白包被酶標板的加樣孔，在密封的濕盒內(nèi)4℃孵育過夜。每一個克隆包被一列。
11. 傾去靶溶液，并將板子反扣在吸水紙上盡量吸干。在每一個孔中加滿封閉緩沖液。另外，每個克隆都需要封閉一列未包被的加樣孔，以檢測其與BSA包被板子的結(jié)合。封閉另一個酶標板用來稀釋噬菌體，這樣可以保證稀釋過程中噬菌體不被靶蛋白吸收。4℃封閉1~2h。
12. 傾去封閉液，用1×TBS/Tween洗滌板子6次，每次都將酶標板反扣在吸水紙上盡量吸干。Tween的濃度應(yīng)該與篩選洗滌步驟的濃度相同。
13. 用TBS/Tween 4倍比稀釋噬菌體，200ml/孔，*孔為1012顆粒，第十二孔為2×105顆粒。
14. 用多道加樣槍，將每一列倍比稀釋的噬菌體轉(zhuǎn)至靶蛋白包被的酶標板內(nèi)。室溫振蕩孵育1~2h。
15. 用1×TBS/Tween洗板6次。
16. 用封閉緩沖液稀釋HRP標記的抗M13抗體，稀釋度為1：5000，每孔加入200ml，室溫振蕩孵育1h。
17. 用1×TBS/Tween洗板6次。
18. 制備HRP底物緩沖液。ABTS貯存液：在100ml 50mM的檸檬酸鈉溶液（pH 4.0）中溶解22mgABTS，過濾除菌貯存在4℃。使用液要新鮮配制，在21ml ABTS貯存液中加入36ml 30%H2O2，用于一個酶標板。
19. 每孔加入200ml底物緩沖液，室溫孵育10~60min。
20. 酶標儀檢測405~415nm處的OD值。
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