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上海鈺博生物科技有限公司
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閱讀：88發布時間：2017-7-18
細胞支原體污染的PCR檢測
支原體菌株來源：
M.Arginini ATCC23838 精氨酸支原體
M.FermentaneATCC19989發酵支原體
M.SalivariumATCC23064唾液支原體
M.HominisATCC23114人型支原體
M.OraleATCC23714口腔支原體
M.HyorhinisATCC29052豬鼻支原體
其共同引物序列來自16s和23s保守區域
外部引物為Ｆ1 5′-ＡＣＡＣＣＡＴＧＧＧＡＧＣＴＧＧＴＡＡＴ-3′
Ｒ1 5′-ＧＴＴＣＡＴＣＧＡＣＴＴＴＣＡＧＡＣＣＣＡＡＧＧＣＡＴ-3′；
內部引物為Ｆ2 5′-ＧＴＴＣＴＴＴＧＡＡＡＡＣＴＧＡＡＴ-3′
Ｒ2 5′-ＧＣＡＴＣＣＡＣＣＡＡＡＡＡＣＴＣＴ-3′
ＰＣＲ反應體系和條件：
10×緩沖液(10ｍＭＴｒｉｓ-ＨＣｌ、500ｍＭＫＣｌ、20ｍＭＭｇＣｌ2、0.01%明膠)、
ＰｒｉｍｅｒＦ1、Ｒ1、Ｆ2、Ｒ2的濃度為2ｎｍｏｌ/μＬ、
2.5ｍＭｄＮＴＰｓ、
Ｔａｑ酶、
Ｈ2Ｏ、
石蠟油覆蓋
反應溫度和時間為:
94℃ /2ｍｉｎ預變性、94℃/30ｓ變性、55℃/1ｍｉｎ退火、72℃/1ｍｉｎ延伸
循環30次后72℃延伸5ｍｉｎ
第1次ＰＣＲ反應取模板 10μＬ,第2次ＰＣＲ反應以第1次ＰＣＲ擴增產物為模板取1μＬ。
下面是更詳細的：
污染測試——支原體：PCR方法
原理： 利用具特殊專一性之primers，經由PCR反應來復制mycoplasma DNA。所用之primers來自mycoplasma之conserved 16S-23S rRNA序列，由于此段spacer之序列依mycoplsma種類不同而不同，因此可依所復制之DNA大小及其restriction fragment大小差異來作偵測與鑒定。
特點：靈敏(e.g. 0.1~1.6 CFU / 5 ul sample) 與快速(一天)。可偵測不易培養之mycoplasma (e.g. M. hyorhinis)。不需培養mycoplasma作為正反應對照組，避免可能之污染。
缺點：PCR反應很靈敏，易有偽陽性結果。此方法尚在評估中，故結果僅作為參考和內部品管之一部份。
材料與設備：
ATCC mycoplasma detection kit:可作50～100 reactions.
提供1st stage primer mixture與2nd stage primer mixture
positive control DNA (A. laidlawii ; M. pirum)
PCR reagents :
Taq polymerase ( 5 U / ul )
dNTP( dGTP, dCTP, dTTP, dATP, 1.25 mM each )
10x PCR buffer (with 1.5mM MgCl2)
25mM MgCl2
sterile ddH2O
Machine / Equipment：
PCR thermal cycler
agarose電泳設備
DNA電泳膠體觀察設備
無菌PCR反應管
無菌1.5 ml微量離心管
無菌2ul, 20ul, 200ul, 1000ul Tips/ Pipetmans
方法： 此PCR反應是一種nested PCR，包括2階段PCR反應，1st stage PCR結束后，取其反應物作2nd stage PCR，然后取2nd PCR產物作agarose gel electrophoresis，依DNA band之有無及片段大小來分析結果。
結果：使用UV light觀察，并照相記錄。
不過應用較多還是巢式PCR
方法再詳盡點：
1st stage PCR reaction（total volume 25 ul）：
測試樣品 ( 2 ul / each )
直接取樣測試細胞之培養液。
Positive control : mycoplasma DNA ( A. laidlawii ; M. pirum )
Negative control : ddH2O
Reaction mixture ( 23 ul / each )
10x PCR buffer (含1.5 mM MgCl2 ) 2.5 ul
1st stage primer mixture 0.5 ul
dNTP ( 1.25 mM each ) 1.0 l
MgCl2 ( 25 mM ) 0.5 ul
Taq DNA polymerase ( 5 U/ul ) 0.1 ul
ddH2O 18.4 ul
PCR program ( 1st PCR與2nd PCR相同)：使用PCR thermal cycler
step 1 : denaturation: 94 ℃ 30 sec
step 2 : denaturation: 94 ℃ 30 sec
step 3 : annealing: 55 ℃ 2 min
step 4 : extension: 72 ℃ 2 min
重復3.1.3.2至3.1.3.4步驟30 cycles
step 5 : final extension 72 ℃ 5 min
2nd stage PCR reaction（total volume 25 ul）
測試樣品：1st stage PCR product（1 ul / each）。
Reaction mixture ( 24 ul / each )
10x PCR buffer (含1.5 mM MgCl2 ) 2.5 ul
nd stage primer mixture 0.5 ul
dNTP ( 1.25 mM each ) 1.0 ul
MgCl2 ( 25 mM ) 0.5 ul
Taq DNA polymerase ( 5U/ul ) 0.1 ul
ddH2O 19.4 ul
PCR program同3.1.3；使用PCR thermal cycler
膠片電泳分析
膠片 (2.0%) 置備: 將2 g agarose溶于100 ml ( 1x ) TAE buffer。
電泳液：(1x) TAE buffer（Tris-acetate/EDTA electropheresis buffer）
選擇100~500 bp DNA size Marker：取100 bp ladder Marker 5 ul ( 25 ng/ul )
取10 ul 2 nd stage PCR產物分析，各加入2 ul ( 6x ) loading dye。
進行電泳分離100V, 25 min。
膠片染色：ethidium bromide染色10 min，H2O退染10mim。（EtBr為致癌物質，請戴手套并小心操作）
結果：使用UV light觀察，并照相記錄。
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