上海駟芮科技有限公司
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特點
液相色譜法有“四高一廣”的特點：
①高壓：流動相為液體，流經(jīng)色譜柱時，受到的阻力較大，為了能迅速通過色譜柱，必須對載液加高壓。
②高速：分析速度快、載液流速快，較經(jīng)典液體色譜法速度快得多，通常分析一個樣品在15～30分鐘，有些樣品甚至在5分鐘內即可完成，一般小于1小時。
③：分離效能高。可選擇固定相和流動相以達到分離效果，比工業(yè)精餾塔和氣相色譜的分離效能高出許多倍。
④高靈敏度：紫外檢測器可達0.01ng，進樣量在μL數(shù)量級。
⑤應用范圍廣：百分之七十以上的有機化合物可用液相色譜分析，特別是高沸點、大分子、強極性、熱穩(wěn)定性差化合物的分離分析，顯示出優(yōu)勢。
⑥柱子可反復使用：用一根柱子可分離不同化合物
⑦樣品量少、容易回收：樣品經(jīng)過色譜柱后不被破壞，可以收集單一組分或做制備。
此外液相色譜還有色譜柱可反復使用、樣品不被破壞、易回收等優(yōu)點，但也有缺點，與氣相色譜相比各有所長，相互補充。液相色譜的缺點是有“柱外效應”。在從進樣到檢測器之間，除了柱子以外的任何死空間（進樣器、柱接頭、連接管和檢測池等）中，如果流動相的流型有變化，被分離物質的任何擴散和滯留都會顯著地導致色譜峰的加寬，柱效率降低。液相色譜檢測器的靈敏度不及氣相色譜。
類型
1．吸附色譜法(Adsorption Chromatography)
2．分配色譜法(Partition Chromatography)
3．離子色譜法(Ion Chromatography)
4．分子排阻色譜法/凝膠色譜法(Size Exclusion Chromatography)
5．鍵合相色譜法（bonded-phase chromatography）
6．親和色譜法(Affinity Chromatography)
結構
組成
可分為“高壓輸液泵”、“色譜柱”、“進樣器”、“檢測器”、“餾分收集器”以及“數(shù)據(jù)獲取與處理系統(tǒng)”等部分。
技術動態(tài)
液相色譜和質譜連接，可以增加額外的分析能力，能夠準確鑒定和定量像細胞和組織裂解液，血液，血漿，尿液和口腔液等復雜樣品基質中的微量化合物。液相色譜質譜系統(tǒng)（ABSciex Eksigent LC / MS和LC / MS / MS）提供了一些*的優(yōu)勢，包括：
快速分析和流轉所需的zui少樣品準備
高靈敏度并結合可分析多個化合物能力，甚至可以跨越化合物的種類
高度，高分辨率鑒定和量化目標分析物
高壓輸液泵
功能
驅動流動相和樣品通過色譜分離柱和檢測系統(tǒng)；
性能要求
流量穩(wěn)定（±1)，耐高壓(30～60Mpa)，耐各種流動相：例如：有機溶劑、水和緩沖液；
種類
往復泵和隔膜泵。
色譜柱
功能
分離樣品中的各個物質；
尺寸
10～30cm長，2～5mm內徑的內壁拋光的不銹鋼管柱；
填料粒度
5 ～10μm ，微粒固定相；
進樣器
功能
將待分析樣品引入色譜系統(tǒng)；
種類
①注射器，10Mpa以下，1～10μm微量注射器進樣
②停流進樣
③閥進樣，常用、較理想、體積可變，可固定
④自動進樣器，有利于重復操作，實現(xiàn)自動化
檢測器
功能
將被分析組在柱流出液中濃度的變化轉化為光學或電學信號；
分類
①示差折光化學檢測器
②紫外吸收檢測器
③紫外-可見分光光度檢測器
④二極管陣列紫外檢測器
⑤熒光檢測器
⑥電化學檢測器
餾分收集器
功能
如果所進行的色譜分離不是為了純粹的色譜分析，而是為了做其它波譜鑒定，或獲取少量試驗樣品的小型制備，餾分收集是必要的；
方法
①手工，少數(shù)幾個餾分，手續(xù)麻煩，易出差錯。
②餾分收集器收集，比較理想，微機控制操作準確。
數(shù)據(jù)
獲取與處理功能
把檢測器檢測到的信號顯示出來。
色譜柱
填料和流動相的組分
應按各品種項下的規(guī)定，常用的色譜柱填料有硅膠和化學鍵合硅膠。后者以十八烷基硅烷鍵合硅膠zui為常用辛基鍵合硅膠次之，氰基或氨基鍵合硅膠也有使用；離子交換填料用于離子交換色譜；凝膠或玻璃微球等，用于分子排阻色譜等。注樣量一般為數(shù)微升。除另有規(guī)定外，柱溫為室溫，檢測器為紫外吸收檢測器。
在用紫外吸收檢測器時，所用流動相應符合紫外分光光度法項下對溶劑的要求。
正文中各品種項下規(guī)定的條件除固定相種類、流動相組分、檢測器類型不得任意改變外，其余如色譜柱內徑、長度、固定相牌號、載體粒度、流動相流速、混合流動相各組分的比例、柱溫、進
樣量、檢測器的靈敏度等，均可適當改變。
以適應具體品種并達到系統(tǒng)適用性試驗的要求。一般色譜圖約于20分鐘內記錄完畢。
系統(tǒng)適用性
按各品種項下要求對儀器進行適用性試驗，即用規(guī)定的對照品對儀器進行試驗和調整，應達到規(guī)定的要求；或規(guī)定分析狀態(tài)下色譜柱的zui小理論板數(shù)、分離度和拖尾因子.
色譜柱
在選定的條件下，注入供試品溶液或各品種項下規(guī)定的內標物質溶液，記錄色譜圖
，量出供試品主成分或內標物質峰的保留時間t(R)和半高峰寬W(h/2)，按n=5.54[t(R)╱W(h/2)]^2計算色譜柱的理論板數(shù)，如果測得理論板數(shù)低于各品種項下規(guī)定的zui小理論板數(shù)，應改變色譜柱的某些條件（如柱長、載體性能、色譜柱充填的優(yōu)劣等），使理論板數(shù)達到要求。
分離度
定量分析時，為便于準確測量，要求定量峰與其他峰或內標峰之間有較好的分離度。分離度(R)的計算公式為：R=2(tR2-tR1)/(W1+W2)， 式中 t(R2)為相鄰兩峰中后一峰的保留時間； t(R1)為相鄰兩峰中前一峰的保留時間； W1及W2為此相鄰兩峰的峰寬。除另外有規(guī)定外，分離度應大于1.5。
拖尾因子
為保證測量精度，特別當采用峰高法測量時，應檢查待測峰的拖尾因子(T)是否符合各品種項下的規(guī)定或不同濃度進樣的校正因子誤差是否符合要求。拖尾因子計算公式為：
T(拖尾因子)=W0.05h/2d1式中 W(0.05h)為0.05峰高處的峰寬；
d1為峰至峰前沿之間的距離。除另有規(guī)定外,T應在0.95～1.05間。
也可按各品種校正因子測定項下，配制相當于80%、100%和120%的對照品溶液，加入規(guī)定量的內標溶液，配成三種不同濃度的溶液，分別注樣3次，計算平均校正因子，其相對標準偏差應不大于2.0%。
測定
定量測定時，可根據(jù)樣品的具體情況采用峰面積法或峰高法。但用歸一法或內標法測定雜質總量時，須采用峰面積法。
面積歸一化法
測定供試品（或經(jīng)衍生化處理的供試品）中各雜質及雜質的總量限度采用不加校正因子的峰面積歸一法。計算各雜質峰面積及其總和，并求出占總峰面積的百分率。但溶劑峰不計算在內。色譜圖的記錄時間應根據(jù)各品種所含雜質的保留時間決定，除另有規(guī)定外可為該品種項下主成分保留時間的倍數(shù)。
主成分自身對照法
當雜質峰面積與成分峰面積相差懸殊時，采用主成分自身對照法。在測定前，先按各品種項下規(guī)定的雜質限度，將供試品稀釋成一定濃度的溶液作為對照溶液，進樣，調節(jié)檢測器的靈敏度或進樣量，使對照溶液中的主成分色譜峰面積滿足準確測量要求。然后取供試品溶液，進樣，記錄時間，除另有規(guī)定外，應為主成分保留時間的倍數(shù)。根據(jù)測得的供試品溶液的各雜質峰面積及其總和并和對照溶液主成分的峰面積比較，計算雜質限度。
內標法 測定供試品中雜質的總量限度
采用不加校正因子的峰面積法。取供試品，按各品種項下規(guī)定的方法配制不含內標物質的供試品溶液，注入儀器，記錄色譜圖Ⅰ；再配制含有內標物質的供試品溶液，在同樣的條件下注樣，記錄色譜圖Ⅱ。記錄的時間除另有規(guī)定外，應為該品種項下規(guī)定的內標峰保留時間的倍數(shù)，色譜圖上內標峰高應為記錄儀滿標度的30%以上，否則應調整注樣量或檢測器靈敏度。
如果色譜圖Ⅰ中沒有與色譜圖Ⅱ上內標峰保留時間相同的雜質峰，則色譜圖Ⅱ中各雜質峰面積之和應小于內標物質峰面積（溶劑峰不計在內）。如果色譜圖Ⅰ中有與色譜圖Ⅱ上內標物質峰保留時間相同的雜質峰，應將色譜圖Ⅱ上的內標物質峰面積減去色譜圖Ⅰ中此雜質峰面積，即為內標物質峰的校正面積；色譜圖Ⅱ中各雜質峰總面積加色譜圖Ⅰ中此雜峰面積，即為各雜質峰的校正總面積，各雜質峰的校正總面積應小于內標物質峰的校正面積。
加校正因子測定供試品主成分含量
按各品種項下的規(guī)定，精密稱（量）取對照品和內標物質，分別配成溶液，精密量取各溶液，配成校正因子測定用的對照溶液，取一定量注入儀器，記錄色譜圖，測量對照品和內標物質的峰面積或峰高，按下式計算校正因子：
As/ms]校正因子f=- Ar/mr 式中 As為內標物質的峰面積或峰高,Ar為對照品的峰面積或峰高； ms為加入內標物質的量mr為加入對照品的量。再取各品種項下含有內標物質的供試品溶液，注入儀器，記錄色譜圖，測量供試品（或其雜質）峰和內標物質的峰面積或峰高，按下式計算含量：Ax 含量(mx)=f×-As/ms 式中 Ax為供試品（或其雜質）峰面積或峰高； mx為供試品（或其雜質）的量。f、As和ms的意義同上。
當配制校正因子測定用的對照溶液和含有內標物質的供試品溶液使用同一分內標物質溶液時，則配制內標物質溶液不必精密稱（量）取。
外標法 測定供試品中含量
按各品種項下的規(guī)定，精密稱（量）取對照品和供試品，配制成溶液，分別精密取一定量，注入儀器，記錄色譜圖，測量對照品和供試品待測成分的峰面積（或峰高），按下式計算含量：
A<[x]> 含量(mx)=mr×-Ar式中各符號意義同上
由于微量注射器不易控制進樣量，當采用外標法測定供試品中某雜質或主成分含量時，以定量環(huán)進樣為好。
綜述
要正確地選擇色譜分離方法，首先必須盡可能多的 了解樣品的有關性質，其次必須熟悉各種色譜方法的主要特點及其應用范圍。選擇色譜分離方法的主要根據(jù)是樣品的相對分子質量的大小，在水中和有機溶劑中的溶解度，極性和穩(wěn)定程度以及化學結構等物理、化學性質。
相對分子質量
對于相對分子質量較低（一般在200以下），揮發(fā)性比較好，加熱又不易分解的樣品，可以選擇氣相色譜法進行分析。相對分子質量在200 ~ 2000的化合物，可用液固吸附、液-液分配和離子交換色譜法。相對分子質量高于2000，則可用空間排阻色譜法。
溶解度
水溶性樣品用離子交換色譜法和液液分配色譜法；微溶于水，但在酸或堿存在下能很好電離的化合物，也可用離子交換色譜法；油溶性樣品或相對非極性的混合物，可用液-固色譜法。
化學結構
若樣品中包含離子型或可離子化的化合物，或者能與離子型化合物相互作用的化合物（例如配位體及有機螯合劑），可首先考慮用離子交換色譜，但空間排阻和液液分配色譜也都能順利地應用于離子化合物；異構體的分離可用液固色譜法；具有不同官能團的化合物、同系物可用液液分配色譜法；對于高分子聚合物，可用空間排阻色譜法。
