Cy3 NHS ester/Cy5 NHS ester/Cy7 NHS ester（菁染料琥珀酰亞胺酯）的使用說明書包含標記抗體蛋白和小鼠體內(nèi)活體成像實驗步驟。

Sulfo Cy3 NHS ester/ Sulfo Cy5 NHS ester/ SulfoCy7 NHS ester（水溶性磺酸基菁染料琥珀酰亞胺酯）的使用說明書包含標記抗體蛋白和小鼠體內(nèi)活體成像實驗步驟。

菁染料是近紅外熒光染料中zui常用的一類熒光染料，統(tǒng)的可見光染料相比有顯著的優(yōu)勢。由于細胞和組織的自發(fā)熒光在近紅外波段zui小，因此在檢測復雜生物系統(tǒng)時，近紅外染料能提供更高的特異性和靈敏度。同時，由于光波在近紅外區(qū)段的組織透過性更好。菁染料的摩爾吸光系數(shù)在熒光染料中是zui高的，Cy5 hydrazide, Cy3 amine 和Cy7 NHS ester 的吸收在近紅外區(qū)背景非常低，是熒光強度zui高、zui穩(wěn)定的長波長染料。特別適合于活體小動物體內(nèi)成像代替放射性元素。

磺酸化菁染料和非磺酸化菁熒光染料可以用于標記各種不同的目標分子：

•    可在有機溶劑中溶解的蛋白質(zhì)
•    抗體 (use 5-10% of DMSO/DMF)
•    DNA和寡核苷酸
•    多肽
•    其他小分子，包括藥用小分子及抑制劑

磺酸化菁熒光染料可用于：

•         在DMF或DMSO中變性的敏感蛋白
•         被透析及純化的蛋白
•         水溶性的納米粒子
•         不溶或疏水的蛋白

非磺酸化菁熒光染料可用于：

•         在有機介質(zhì)反應(yīng)（二氯甲烷、乙腈）

產(chǎn)品說明：

    菁染料是性能優(yōu)良的熒光標記染料，摩爾吸光系數(shù)在熒光染料中是zui高的，其琥珀酰亞胺酯是zui常用的脂肪氨基標記試劑，廣泛用于蛋白、抗體、核酸及其他生物分子的標記和檢測。通過改變次甲基鏈的長度，可改變其熒光發(fā)射波長，每增加一個雙鍵，按照Huoffman 規(guī)則正好紅移約100nm。

    菁染料Cy3 和Cy5 已成為基因芯片的熒光標記物；另外，Cy5， Cy5.5 和Cy7 的吸收在近紅外區(qū)背景非常低，是熒光強度zui高、zui穩(wěn)定的長波長染料。特別適合于活體小動物體內(nèi)成像代替放射性元素。但由于菁染料，尤其是不對稱菁染料的合成副反應(yīng)多，副產(chǎn)物極性相近，產(chǎn)物的分離提純相當困難。菁染料特別是水溶性菁染料分子極性大，分離提純越加困難。

Cyanine3 NHS ester（Cy3@SE）

Cyanine5 NHS ester（Cy5@SE）

Cyanine7 NHS ester（Cy7@SE）

Sulfo Cyanine3 NHS ester（SF Cy3@SE）

Sulfo Cyanine5 NHS ester（SF Cy5@SE）

Sulfo Cyanine7 NHS ester（SF Cy7@SE）

圖1. 脂溶性菁染料琥珀酰亞胺酯的結(jié)構(gòu)式     圖2. 水溶性菁染料琥珀酰亞胺酯的結(jié)構(gòu)式

圖3 菁染料琥珀酰亞胺酯的激發(fā)和發(fā)射波長光譜圖

菁染料琥珀酰亞胺酯（Cy3 NHS）的標記：

菁染料和生物分子的比例F/P=4～12之間熒光強度zui高， F/P值過高熒光探針會自我淬滅并影響生物分子的生物活性，標記生物分子是用單琥珀酰亞胺酯，但是用雙修飾的CyDye NHS并沒有發(fā)現(xiàn)交聯(lián)。CyDye NHS標記抗體在pH (8.5～9.4)時10分鐘F/P可達5～6，而在pH 7.0幾乎不反應(yīng)。我們用不同比例的Cy3標記anti-glutathione-S-transferase(GST)多克隆抗體發(fā)現(xiàn)用1:1，5:1，10:1 和 20:1標記時得到的F/P值分別是 0.28:1，1.16:1，2.3:1和4.6:1。

操作步驟：

一、 水溶性Cy3 NHS ester標記anti-GST多克隆抗體

市場上買到的抗體如果含有其它蛋白（例如serum albumin或gelatin等）或帶氨基的緩沖液會影響標記，在標記前需純化。

1. 在1 L 0.15 M NaCl 溶液中透析anti-GST抗體(濃度為 0.5 mL at3 mg/mL)，常溫透析4小時。

2. 在4°C用新鮮的1 L 0.15 MNaCl 溶液再透析過夜。

3. 第二天用1 L 0.1 M NaHCO3 (pH 8.3)透析4小時。

4. 用0.22 μm注射器過濾頭過濾抗體溶液。

5. 用0.1 M NaHCO3 稀釋少量的抗體，在280nm處測其紫外吸收值計算標記抗體的總量 （IgGantibody摩爾吸光系數(shù)170 000 M-1 cm-1 at 280 nm).

6. 用DMSO配置Cy3 NHS (MW765.95) 溶液濃度為10 mg/mL；計算所需體積以得到想要的CyDye NHS 和抗體的比值(例如20:1)，然后慢慢將其加入到抗體溶液中，同時在暗處常溫緩慢攪拌45分鐘。

7. 用1 L 0.15 M NaCl 溶液常溫避光透析4小時除去未標記上的Cy3。

8. 在4°C用新鮮的1 L 0.15 MNaCl 溶液再避光透析過夜。

9. 用1 L of 0.01 M PBS/ 0.01% *溶液常溫避光透析4小時， 在4°C常溫避光再次透析過夜。

10. 用0.22 μm注射器過濾頭過濾抗體溶液。

11. 用0.01 M PBS/0.01 % *整數(shù)倍稀釋標記抗體溶液，測量280nm（蛋白）和552nm（Cy）處的紫外可見吸光度。

12. 產(chǎn)品冷凍干燥成粉末或在0.01 M PBS/ 0.01% *溶液中，-20℃避光儲存。

F/P計算：

Cy3在552nm摩爾吸光系數(shù)為150 000M-1cm-1；此蛋白在280nm的摩爾吸光系數(shù)為170 000

M-1cm-1；不同蛋白的摩爾吸光系數(shù)不一樣；Cy3 染料本身在280 nm 的吸收是552nm處的8%。

按以下公式計算F/P值。

[Cy3] = A552/150000

[antibody] = {A280 - (0.08×A552)}/170000

F/P final= [Cy3]/[antibody]= {1.13×A552}/{A280 - (0.08×A552)}

二、 水溶性Cy5 NHS ester標記 (D-ser2)-leucineenkephalin

1. Cy5 NHS 1.0 mg溶解于400 μL DMSO后，加入到1mL 的玻璃瓶中盛有(D-ser2)-leucine- enkephalinacetate(YSGFLT，0.75 mg) 的400 μL DMSO溶液。（Dye 和peptide 投料比是 1:1）

2. 然后加入15 μL三乙胺，常溫避光攪拌反應(yīng)混合物過夜。

3. 用HPLC 純化蛋白，使用蛋白C18柱子(25 cm×10 mm)，每次上樣注入2×400 μL，30分鐘梯度洗脫。從0.1% TFA水溶液到MeCN∶H2O（0.1% TFA）=70∶30，流速4mL /min。（對不同的蛋白選擇不同的合適HPLC梯度流動相）

4. 收集適當?shù)纳珟Х澹瑯擞浂嚯牡谋Ａ魰r間比未標記的多肽長。

5. 產(chǎn)品冷凍干燥成粉末或在水溶液中，-20℃避光儲存；必要時可用質(zhì)譜表征。

6. CyDye標記的蛋白穩(wěn)定性取決于蛋白本身。例如標記的IgG在4 ℃可避光保存2月；更長期的保存需加入等體積的甘油-20 ℃避光保存。

F/P計算：

Cy5 在650 nm 的摩爾吸光系數(shù)為250 000 M-1cm-1 ，所用蛋白在280 nm處的摩爾吸光系數(shù)為170000M-1cm-1；Cy5在280nm處的吸收是650nm處的5%。按以下公式計算F/P值。

[Cy5 dye] = (A650)/250 000

[peptide] =[A280 -(0.05×A650)]/170000

F/P final= [dye]/[peptide]= {0.68×A650}/{A280 - (0.05×A650)}

三、 水溶性Sulfo Cy3 NHS ester 標記OLIGO

氨基封端的OLIGO可以標記CyDye SE，但是非常困難；標記前因為OILGO經(jīng)氨水脫保護，請務(wù)必洗滌掉所有的殘余氨水。然后將樣品真空干燥；然后溶于0.25ml 的0.5 M NaCl 溶液中，用Sephadex G-50脫鹽，用5.0 mM borate 緩沖液平衡到pH=8.0，然后用以上硼酸緩沖液沖下OLIGO。

然后濃縮至干的樣品溶于0.1M carbonate buffer (pH 8.5-9.0)；在0.5mL碳酸緩沖液中30nmoles的OLIGO加入到CyDye SE的玻璃瓶中室溫避光，密閉攪拌反應(yīng)60min。反應(yīng)物經(jīng)Sephadex G-50或RP-HPLC過柱純化，冷凍干燥后避光保存。

注意：Oligonucleotides和oligopeptides由于太小經(jīng)常會留在過濾膜上或在凍存管內(nèi)貼壁成膜，而無法標記。

四、 小動物活體成像領(lǐng)域的應(yīng)用

活體動物體內(nèi)成像技術(shù)是指應(yīng)用影像學方法，對活體狀態(tài)下的生物過程進行組織、細胞和分子水平的定性和定量研究的技術(shù)。小動物活體成像是近年來在生物醫(yī)藥方面非常活躍和前沿的領(lǐng)域，在研究細胞行為，藥物活性和代謝，疾病的進展等方向取得了革命性的進步。分為生物發(fā)光成像（以Caliper和Xengon 儀器為代表）和熒光成像（以KODAK 和CRI 儀器為代表）。

1、熒光成像的推薦步驟：

（1） SPF級 BALB/C裸鼠，6～8 周齡，18～20克，實驗前24 h 自由進食、飲水。

（2） 于實驗裸鼠腹腔內(nèi)注射2%戊巴比妥鈉300μL(215mg/ kg)麻醉動物。將裸鼠俯臥位平放于小動物多光譜活體成像系統(tǒng)的記錄暗箱中。實驗時將Cy7或Cy7標記的生物分子或藥物溶于水（或甲醇/乙醇/乙二醇，有時DMSO 200uL能把小鼠殺死）稀釋后，于裸鼠尾靜脈注射200μL（濃度0.5 mg/mL），用量和時間需要客戶根據(jù)自己的儀器和藥物試劑等條件優(yōu)化。每5min記錄1 張動物在體內(nèi)發(fā)射熒光的成像圖片，分析熒光藥物的分布情況。對照鼠不注射藥物，進行同時記錄。記錄結(jié)束后迅速解剖裸鼠的心、肝、脾、肺、腎等臟器，進行成像。

（3） Cy7 檢測時激發(fā)波長700～770 nm 帶通，發(fā)射波長790 nm 長通。液晶可調(diào)諧濾光片掃描范圍 780～950 nm，掃描步進10 nm。曝光時間為500 ms。不同的藥物代謝時間不一樣，注射入裸鼠體內(nèi)，熒光立即分布全身，然后逐步向膀胱聚集，呈現(xiàn)顯著的腎排泄的特點一般4～6 小時，快的只有30 分鐘；如果是骨骼和鼻腔等部位靶點的Cy7 標記藥物，有客戶反映一周后活體成像系統(tǒng)仍能檢測到熒光成像。器官切片觀察：將解剖的器官迅速放置于4%多聚甲醛固定4 小時以上，0%，20%，30%PBS 蔗糖依次沉底，20μm 切片，多聚賴氨酸洗過的載玻片貼片，晾干，DAPI 染色。共聚焦顯微鏡觀察，激光器為氦氖 633 nm。

2、熒光成像常見問題

（1） 什么類型的小鼠適合活體成像？

毛發(fā)對光有散射，建議用裸鼠。

（2） 給裸鼠注射的恰當和zui大注射試劑體積？

試劑的體積用量根據(jù)所采取的方式不同而不同，下面是體重25g 的裸鼠注射量。

（3） 注射針頭的尺寸是多少？

推薦使用具有固定針頭的28～32 號結(jié)核菌素或胰島素注射器（0.3 或1mL）

（4） 腫瘤成像需要注射多大劑量的標記抗體？

推薦起始用量50μg 來優(yōu)化用量。

（5） 未標記的染料在老鼠體內(nèi)如何代謝？

未標記水溶性染料通過膀胱排泄，靜脈注射后zui快能在3min 檢測到膀胱內(nèi)的熒光信號。

（6） 注射后多長時間開始成像？

成像時間和成像持續(xù)時間與注射試劑有關(guān)。血管示蹤劑注射后馬上即可成像并持續(xù)成像數(shù)小

時。注射標記的抗體IgG 到達靶點需要數(shù)小時，而后才成像并持續(xù)成像數(shù)天。

（7） Solar Fluor dyes 的熒光壽命是多少？

Solar Fluor 647 在20°C 水中τ＝1 ns

Solar Fluor 680 在20°C 水中τ＝1.2 ns

Solar Fluor 750 在20°C 水中τ＝0.7 ns

穩(wěn)定性與儲存：

未開封的粉末在避光干燥-20℃存放12月。CyDye NHS水溶液現(xiàn)配現(xiàn)用不能儲存。任何溶解后的CyDye NHS粉末立即使用；無水的DMSO溶液-20°C保存zui多2個星期。

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菁染料產(chǎn)品：

Cyanine3 alkyne

Cy3 alkyne

Cyanine3 azide

Cy3 azide                

Cy3 N3

Cyanine3 carboxylic acid  1144107-76-5

Cy3 carboxylic acid

Cyanine3 hydrazide

Cyanine3 maleimide

Cy3 maleimide

Cyanine3 NHS ester   1032678-38-8

Cy3 NHS ester

Cyanine3.5 azide

Cyanine3.5 carboxylic acid  1144107-79-8

Cyanine3.5 NHS ester

Cy3.5 NHS ester

Cyanine5 alkyne

Cyanine5 amine

Cy5 amine

Cy5 NH2

Cyanine5 azide

Cy5 N3

Cyanine5 Boc-hydrazide

Cyanine5 carboxylic acid

Cyanine5 hydrazide

Cyanine5 maleimide

Cy5 maleimide

Cyanine5 NHS ester  1032678-42-4

Cy5 NHS ester

Cyanine5.5 alkyne

Cyanine5.5 azide

Cyanine5.5 carboxylic acid  1144107-80-1

Cyanine5.5 maleimide

Cyanine5.5 NHS ester

Cyanine7 amine   1650635-41-8

Cy7 amine

Cy7 NH2

Cyanine7 azide

Cy7 azide

Cyanine7 carboxylic acid

Cyanine7 maleimide

Cy7 maleimide

Cyanine7 NHS ester

Cy7 NHS ester

Cyanine7.5 amine

Cyanine7.5 azide

Cyanine7.5 carboxylic acid   1686147-68-1

Cyanine7.5 maleimide

Cyanine7.5 NHS ester

Sulfo-Cyanine 5 NHS ester

Sulfo-Cy 5 NHS ester

Sulfo-Cyanine3 azide

Sulfo-Cy3 azide

Sulfo-Cyanine3 carboxylic acid

Sulfo-Cyanine3 maleimide

Sulfo-Cy3 maleimide

Sulfo-Cyanine3 NHS ester

Sulfo-Cy3 NHS ester

Sulfo-Cyanine5 alkyne

Sulfo-Cyanine5 azide

Sulfo-Cy5 azide

Sulfo-Cyanine5 carboxylic acid   1121756-16-8

Sulfo-Cyanine5 maleimide

Sulfo-Cy5 maleimide

Sulfo-Cyanine7 azide

Sulfo-Cyanine7 carboxylic acid

Sulfo-Cyanine7 NHS ester

Sulfo-Cy7 NHS ester